發(fā)布時間：2023-03-06 16:02:59
序言：寫作是分享個人見解和探索未知領(lǐng)域的橋梁，我們?yōu)槟x了8篇的學(xué)習(xí)周計劃樣本，期待這些樣本能夠為您提供豐富的參考和啟發(fā)，請盡情閱讀。
關(guān)鍵詞：校園安全；監(jiān)控系統(tǒng)；平安校園
中圖分類號：TP277 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1007-9599 (2011) 14-0000-01
Campus Security System Planning of the College of Science&Technology of Guizhou University
Jiang Ping
(College of Science and Technology of Guizhou University，Information Management and Experimental Center,Guiyang550004,China)
Abstract:Campus safety has become an issue of concern,the college began to focus on building security systems,this paper,the school building security control system described in detail to illustrate the attention to the problem,finally made a security system as a whole school of construction management of the construction of important technologies.
Keywords:Campus safety;Monitoring system;Safe campus
近年來，校園安全已成為一個大家普遍關(guān)注的問題，在容納上千人甚至上萬人的學(xué)校里，這樣的問題更是突出。為提高高校在綜合安全管理上的效能，給高校的安全運(yùn)行提供技術(shù)保證，國家教育部提出了建立"平安校園"的綜合管理平臺，確保構(gòu)建一個和諧平安的綜合校園。貴州大學(xué)科技學(xué)院也積極的投入到“平安校園”的建設(shè)平臺中來。
科技學(xué)院占地面積18萬平方米，校舍建筑面積8萬平方米，學(xué)生宿舍3.15萬平方米，擁有在校師生近萬人。針對于學(xué)員情況決定采用安防監(jiān)控系統(tǒng)進(jìn)行安全防范。安防監(jiān)控系統(tǒng)主要對重點部位和重點區(qū)域進(jìn)行實時監(jiān)控，在學(xué)校的主要地點進(jìn)行布控，包括學(xué)校的大門口、至宿舍樓的主要路段、宿舍樓、教學(xué)樓等地方，并通過硬盤錄像機(jī)實時記錄現(xiàn)場情況，由專人進(jìn)行24小時值班監(jiān)控，同時保持全天不間斷連續(xù)錄像并保存錄像資料30天。
安防監(jiān)控系統(tǒng)是應(yīng)用光纖、同軸電纜或微波在其閉合的環(huán)路內(nèi)傳輸視頻信號，并從攝像到圖像顯示和記錄構(gòu)成獨立完整的系統(tǒng)。它能實時、形象、真實地反映被監(jiān)控對象，不但極大地延長了人眼的觀察距離，而且擴(kuò)大了人眼的機(jī)能，它可以在惡劣的環(huán)境下代替人工進(jìn)行長時間監(jiān)視，讓人能夠看到被監(jiān)視現(xiàn)場的實際發(fā)生的一切情況，并通過錄像機(jī)記錄下來。而閉路電視監(jiān)控系統(tǒng)是安全防范領(lǐng)域中的重要組成部分，系統(tǒng)通過遙控前端攝像機(jī)及鏡頭、云臺等輔助設(shè)備，可以直接觀察被監(jiān)視場所的情況，同時可以把被監(jiān)視場所的情況進(jìn)行同步錄像。另外，電視監(jiān)控系統(tǒng)還可以與監(jiān)聽、防盜報警系統(tǒng)等其他安全技術(shù)防范體系聯(lián)運(yùn)運(yùn)行。
電視監(jiān)控系統(tǒng)由前端攝像機(jī)部分、傳輸部分、控制部分及顯示和存儲部分四大塊組成。其中，監(jiān)控系統(tǒng)前端信號包括視頻、音頻、報警等多種輸入，前端可能是報警器、攝像頭、視頻編碼器、攝像機(jī)等；控制信息、巡查信息、報警信息和視頻信息等，按照工作流程在網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)各級傳輸；通過有線或無線等傳輸媒介，經(jīng)編碼解碼、調(diào)制解調(diào)、光/電或數(shù)/模轉(zhuǎn)換等方式，將前端設(shè)備的圖像及報警信號傳輸至控制設(shè)備。系統(tǒng)中前端監(jiān)控設(shè)備及各級監(jiān)控中心，均可對巡檢、報警、視音頻、系統(tǒng)日志等信息予以存儲。存儲和備份的報警、巡檢等歷史數(shù)據(jù)信息，可在網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)中依據(jù)授權(quán)進(jìn)行訪問。系統(tǒng)應(yīng)能存儲下列信息并保持一定時間，可配置專用存儲設(shè)備備份需要長期保存的信息。并且當(dāng)監(jiān)控點存在報警設(shè)備時系統(tǒng)應(yīng)具有與報警設(shè)備聯(lián)動的接口，報警發(fā)生時能切換出相應(yīng)部位的視音頻及報警信息，并進(jìn)行記錄；對某些特定監(jiān)控點，可實現(xiàn)視頻移動偵測功能；系統(tǒng)支持與其它業(yè)務(wù)系統(tǒng)進(jìn)行報警聯(lián)動接口。
貴大科技學(xué)院校園安防監(jiān)控系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋱D如下：
貴大科技學(xué)院校園安防系統(tǒng)前端設(shè)計44個監(jiān)控點，所有攝像機(jī)通過視頻線分別接入三臺視頻分配器。所有接入視頻分配器的視頻信號一分為二，分別接入硬盤錄像機(jī)和視頻矩陣。矩陣主機(jī)輸出的6路信號接入電視墻的監(jiān)控器，通過控制鍵盤切換任意一路視頻信號在任意監(jiān)控器中顯示。接入硬盤錄像機(jī)的所有視頻信號通過硬盤錄像機(jī)進(jìn)行存儲錄像，錄像時間不少于25天。同時，所有硬盤錄像機(jī)和控制電腦接入交換機(jī)，控制電腦可以通過軟件對硬盤錄像機(jī)進(jìn)行集中管理。
關(guān)鍵詞：項目生命周期；化工單元仿真實訓(xùn)；探析
一、項目生命周期
項目生命周期（Project Life Cycle）是“總體上連續(xù)的各個項目階段的全體，項目階段數(shù)量和名稱由參加項目機(jī)構(gòu)的控制需要所決定”。項目生命期最典型的形式包括四個項目生命期階段：啟動階段（概念階段Conceive phase）、計劃階段（開發(fā)階段Develop phase）、實施階段（執(zhí)行階段Execute phase）和收尾階段（結(jié)束階段Finish phase）。項目生命周期的每一階段都包含一個或幾個“啟動―計劃―執(zhí)行―收尾”的循環(huán)。項目管理是通過諸如啟動、規(guī)劃、實施、控制與收尾等過程進(jìn)行的。項目管理的過程反映了PDCA（Plan、Do、Control、Action）的原則，即事先計劃、事后控制。
在化工單元仿真實訓(xùn)中，仿真實訓(xùn)項目一旦確定，便具有一般項目的特征，所不同的是，一般項目追求的是項目的成果（或完成項目產(chǎn)品），而教學(xué)意義上的項目則將對項目成果的追求作為學(xué)生學(xué)習(xí)活動的主線和驅(qū)動力，真正追求的是學(xué)生在獲得項目成果進(jìn)程中的學(xué)習(xí)和經(jīng)驗的增長，在化工單元仿真實訓(xùn)教學(xué)中，追求的是學(xué)生在獲得項目成果進(jìn)程中對集散控制系統(tǒng)（DCS）操作技能的提高。
二、基于項目生命周期的化工單元仿真實訓(xùn)教學(xué)的過程
基于項目生命周期理論構(gòu)建化工單元仿真教學(xué)模式，將化工單元仿真教學(xué)過程分為項目的啟動、計劃、執(zhí)行和收尾四個階段，如下表所示。
基于項目生命周期的化工單元仿真實訓(xùn)教學(xué)過程
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1.啟動。這一階段由老師和學(xué)生共同完成，首先由老師對化工單元實訓(xùn)項目需要培訓(xùn)的技能目標(biāo)進(jìn)行描述，并把這個實訓(xùn)項目作為一項任務(wù)布置給學(xué)生，學(xué)生接到任務(wù)后，查閱資料，對化工單元仿真實訓(xùn)項目的原理、流程圖、操作步驟進(jìn)行熟悉和掌握。
2.計劃。按照項目生命周期理論，項目進(jìn)行可行性分析后就進(jìn)入到計劃階段。老師根據(jù)化工單元仿真實訓(xùn)項目及學(xué)生的學(xué)情制訂時間表，學(xué)生在此計劃的指導(dǎo)下掌握安全操作規(guī)范并制訂記錄表。
3.執(zhí)行。完成項目計劃后，進(jìn)入到計劃的執(zhí)行階段。學(xué)生根據(jù)制訂的計劃表，按計劃實施。這時老師承擔(dān)的是指導(dǎo)者、觀察員。將化工單元仿真實訓(xùn)項目實訓(xùn)過程分為學(xué)生自主練習(xí)、問題討論、考核三個階段。學(xué)生通過第一階段的自主練習(xí)，將自主練習(xí)中遇到的問題記錄下來進(jìn)行討論及操作經(jīng)驗的交流，從而達(dá)到經(jīng)驗總結(jié)的目的?？偨Y(jié)前一階段的經(jīng)驗和教訓(xùn)后進(jìn)入考核環(huán)節(jié)，考核完成后輸出仿真系統(tǒng)成績考核評價表。
4.收尾。根據(jù)執(zhí)行過程中遇到的問題及成績考核評價表學(xué)生進(jìn)行自評、互評及老師評價。學(xué)生首先對自己的操作過程進(jìn)行自我評價并進(jìn)行總結(jié)，然后學(xué)生在對操作過程進(jìn)行評價，查找操作過程中存在的問題并介紹自己對這類問題的處理辦法。最后由老師對全組學(xué)生的實訓(xùn)操作進(jìn)行總結(jié)和評價，對容易出現(xiàn)操作問題的環(huán)節(jié)和處理辦法重點講解，并對學(xué)生的操作進(jìn)行點評。同時將考核成績記錄歸檔作為平時成績的考核依據(jù)。
基于項目生命周期理論構(gòu)建化工單元仿真教學(xué)模式，將化工單元仿真實訓(xùn)教學(xué)過程分為啟動、計劃、執(zhí)行、收尾四個階段，并將項目管理方法貫穿于整個仿真實訓(xùn)教學(xué)過程，使學(xué)生成為教學(xué)的主角，自主練習(xí)，自由探究，從而有利于對DCS操作技能的訓(xùn)練和掌握。
參考文獻(xiàn)：
[1]戚安邦，張連營.項目管理概論[M].清華大學(xué)出版社，2008.
[2]王敏.基于項目生命周期理論的人事檔案管理信息系統(tǒng)的構(gòu)建：以A校為例[M].江蘇大學(xué)，2010.
1、原始憑證：是指直接記錄經(jīng)濟(jì)業(yè)務(wù)、明確經(jīng)濟(jì)責(zé)任具有法律效力并作為記賬原始依據(jù)的證明文件，其主要作用是證明經(jīng)濟(jì)業(yè)務(wù)的發(fā)生和完成的情況。填寫原始憑證的內(nèi)容為：原始憑證的名稱、填制憑證的日期、編號、經(jīng)濟(jì)業(yè)務(wù)的基本內(nèi)容（對經(jīng)濟(jì)業(yè)務(wù)的基本內(nèi)容應(yīng)從定性和定量兩個方面給予說明，如購買商品的名稱、數(shù)量、單價和金額等），填制單位及有關(guān)人員的簽章。
2、記帳憑證：記帳憑證是登記帳薄的直接依據(jù)，在實行計算機(jī)處理帳務(wù)后，電子帳薄的準(zhǔn)確和完整性完全依賴于記帳憑證，操作中根據(jù)無誤的原始憑證填制記帳憑證。填制記帳憑證的內(nèi)容：憑證類別、憑證編號、制單日期、科目內(nèi)容等。
二、根據(jù)會計憑證登記日記帳。
日記帳一般分為現(xiàn)金日記帳和銀行存款日記帳；他們都由憑證文件生成的。計算機(jī)帳務(wù)處理中，日記帳由計算機(jī)自動登記，日記帳的主要作用是用于輸出現(xiàn)金與銀行存款日記帳供出納員核對現(xiàn)金收支和結(jié)存使用。要輸出現(xiàn)金日記帳和銀行存款日記帳，要求系統(tǒng)初始化時，現(xiàn)金會計科目和銀行存款會計科目必須選擇“日記帳”標(biāo)記，即表明該科目要登記日記帳。
三、根據(jù)記賬憑證及所附的原始憑證登記明細(xì)帳。
明細(xì)分類帳薄亦稱明細(xì)帳，它是根據(jù)明細(xì)分類帳戶開設(shè)帳頁進(jìn)行明細(xì)分類登記的一種帳薄，輸入記帳憑證后操作計算機(jī)則自動登記明細(xì)帳。
四、根據(jù)記賬憑證及明細(xì)帳計算產(chǎn)品成本。根據(jù)記帳憑證及明細(xì)帳用逐步結(jié)算法中的綜合結(jié)轉(zhuǎn)法計算出產(chǎn)品的成本。
五、根據(jù)記賬憑證編科目匯總表。
科目匯總表也由憑證文件生成，其編制方法為對用戶輸入需匯總的起止日期則計算機(jī)自動生成相應(yīng)時間段的科目匯總表。
六、根據(jù)科目匯總表登記總帳。
根據(jù)得出的科目匯總表操作計算機(jī)，計算機(jī)產(chǎn)生出對應(yīng)的總帳。
七、對帳（編試算平衡表）。
對帳是對帳薄數(shù)據(jù)進(jìn)行核對，以檢查記帳是否正確，以及帳薄是否平衡。它主要是通過核對總帳與明細(xì)帳、總帳與輔助帳數(shù)據(jù)來完成帳帳核對。試算平衡表就是將系統(tǒng)中設(shè)置的所有科目的期末余額按會計平衡公式借方余額=貸方余額進(jìn)行平衡檢驗，并輸出科目余額表及是否平衡信息。一般來說計算機(jī)記帳后，只要記帳憑證錄入正確，計算機(jī)自動記帳后各種帳薄應(yīng)該是正確的、平衡的，但由于非法操作，計算機(jī)病毒或其他原因有可能回造成某些數(shù)據(jù)被破壞，因此引起帳帳不符，為保證帳證相符，應(yīng)經(jīng)常進(jìn)行對帳，每月至少一次，一般在月末結(jié)帳前進(jìn)行。
八、根據(jù)給出的相關(guān)內(nèi)容編制本月的負(fù)債表和損益表；
將十二
月月初數(shù)視為年初數(shù)，本月視為本年數(shù)編制會計報表。
資產(chǎn)負(fù)債表是反映企業(yè)在某一特定日期財務(wù)狀況的一種會計報表，它根據(jù)“資產(chǎn)=負(fù)債+所有者權(quán)益”的會計方程式，說明企業(yè)的財務(wù)狀況。
損益表是反映企業(yè)在一定期間內(nèi)的經(jīng)營成果的會計報表，損益表按照權(quán)責(zé)發(fā)生制原則和配比原則把一個會計期間的收入與成本、費(fèi)用進(jìn)行配比，從而計算出報告期的凈損益數(shù)。根據(jù)具體要求操作計算機(jī)得出本月的負(fù)債表和損益表。
通過此次實習(xí)，不僅培養(yǎng)了我的實際動手能力，增加了實際的操作經(jīng)驗，縮短了抽象的課本知識與實際工作的距離，對實際的財務(wù)工作的有了一個新的開始；同時也讓我認(rèn)識到了傳統(tǒng)手工會計和會計電算化的有共同之處和不同之處；
一、共同點為：
1、無論是傳統(tǒng)手工會計和電算化會計其最終目標(biāo)仍是為了加強(qiáng)經(jīng)營管理，提供會計信息，參與經(jīng)濟(jì)決策，提高經(jīng)濟(jì)效益。
2、傳統(tǒng)手工會計和電算化會計都是遵守會計法規(guī)，會計法規(guī)是會計工作的重要依據(jù)。
3、傳統(tǒng)手工會計和電算化會計都遵循基本的會計理論與會計方法及會計準(zhǔn)則。
4、傳統(tǒng)手工會計和電算化會計基本功能相同，基本功能為：信息的采集與記錄、信息的存儲、信息的加工處理、信息的傳輸、信息的輸出。
5、保存會計檔案。
6、編制會計報表。
二、不同點為：
1、運(yùn)算工具不同傳統(tǒng)手工會計運(yùn)算工具是算盤或電子計算器等，計算過程每運(yùn)算一次要重復(fù)一次，由于不能存儲運(yùn)算結(jié)果，人要邊算邊記錄，工作量大，速度慢。電算化會計的運(yùn)算工具是電子計算機(jī)，數(shù)據(jù)處理由計算機(jī)完成，能自動及時的存儲運(yùn)算結(jié)果，人只要輸入原始數(shù)據(jù)便能得到所希望的信息。
2、信息載體不同；傳統(tǒng)手工會計所有信息都以紙張為載體，占用空間大，不易保管，查找困難。電算化會計除了必要的會計憑證之外，均可用磁盤、磁帶做信息載體，它占用空間小，保管容易，查找方便。
3、帳薄規(guī)則不同；傳統(tǒng)手工會計規(guī)定日記帳、總帳要用訂本式帳冊，明細(xì)帳要用活頁式帳冊；帳薄記錄的錯誤要用化線法和紅字法更正；帳頁中的空行、空頁要用紅線劃消。電算化會計不采用傳統(tǒng)手工會計中的一套改錯方案，凡是登記過帳的數(shù)據(jù)，不得更改（當(dāng)然還是要輔以技術(shù)控制），即使有錯，只能采用輸入“更改憑證”加以改正，以留下改動痕跡。對需要打印的帳頁的空行、空頁可以用手工處理。
4、帳務(wù)的處理程序（會計核算形式）不同傳統(tǒng)手工會計處理帳務(wù)的程序有4種，但都避免不了重復(fù)轉(zhuǎn)抄與計算的根本弱點，伴之而來的是人員與環(huán)節(jié)的增多和差錯的增多。成熟的電算化會計的帳務(wù)處理程序用同一模式來處理不同企業(yè)的會計業(yè)務(wù)，成本核算程序以軟件固化形式在計算機(jī)里，從會計憑證到會計報表的過程都由計算機(jī)處理完成后，而任何要求的輸出都能得到滿足。
5、會計工作組織體制不同；傳統(tǒng)手工會計的會計組織工作以會計事物的不同性質(zhì)作為制定的主要依據(jù)；電算化會計組織體制以數(shù)據(jù)的不同形態(tài)做為制定的主要依據(jù)。
6、人員結(jié)果不同；傳統(tǒng)手工會計中的人員均是會計專業(yè)人員，其中的權(quán)威應(yīng)是會計師；電算化會計中的人員由會計專業(yè)人員、電子計算機(jī)軟件、硬件及操作人員組成，其中權(quán)威應(yīng)為掌握電算化會計中級的會計師。
7、內(nèi)部控制不同；傳統(tǒng)手工會計對會計憑證的正確性，一般從摘要內(nèi)容、數(shù)量、單價、金額、會計科目等項目來審核；對帳戶的正確性一般從三套帳的相互核對來驗證；還通過帳證相符、帳帳相符、帳實相符等內(nèi)部控制方式來保證數(shù)據(jù)的正確，堵塞漏洞。電算化會計由于帳務(wù)處理程序和會計工作組體制的變化，除原始數(shù)據(jù)的收集、審核、編碼由原會計人員進(jìn)行外，其余的處理都由計算機(jī)部門負(fù)責(zé)。內(nèi)部控制方式部分被計算機(jī)技術(shù)替代，由手工控制轉(zhuǎn)為人機(jī)控制。
以上種種區(qū)別，集于一點，就是由于電算化會計數(shù)據(jù)處理方式的改變，引起了傳統(tǒng)手工會計各個方面的變化，這一變化將使得系統(tǒng)功能更為加強(qiáng)，系統(tǒng)結(jié)構(gòu)更為合理，系統(tǒng)管理更為完善。
會計電算化是會計史上嶄新的一頁。電子計算機(jī)的應(yīng)用，首先帶來數(shù)據(jù)處理工具的改變，也帶來了信息載體的變化，電算化會計后對傳統(tǒng)會計方法、會計理論都將發(fā)生巨大的影響，從而引起會計制度、會計工作管理體制的變革。會計電算化促進(jìn)著會計的規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化，通用化促進(jìn)著管理的現(xiàn)代化。
關(guān)鍵詞：牛；顆粒細(xì)胞；血清饑餓；同步化；細(xì)胞周期
中圖分類號：Q813；S823．3文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：0439－8114（2012）08－1632-04
自1997年克隆綿羊Dolly誕生以來，體細(xì)胞克隆技術(shù)得到了飛速的發(fā)展，已在許多動物中獲得了成功［1－4］。在體細(xì)胞克隆研究中，供體細(xì)胞的選擇和制備是提高體細(xì)胞克隆效率的關(guān)鍵步驟［5，6］。研究者從供體細(xì)胞的類型、供體來源、培養(yǎng)時間、核質(zhì)同步化處理方法、培養(yǎng)液組成等方面進(jìn)行了大量研究，以期獲得最好的供體細(xì)胞來提高體細(xì)胞克隆的效率。在體細(xì)胞克隆過程中，供體細(xì)胞和受體細(xì)胞核質(zhì)同步化是影響克隆效率的一個關(guān)鍵因素。處于G0／G1期的供體細(xì)胞通常被認(rèn)為是理想的進(jìn)行克隆研究的供體細(xì)胞，血清饑餓是誘導(dǎo)供體細(xì)胞進(jìn)入G0／G1期階段的主要方法［7－9］。雖然人們嘗試使用不同的血清濃度和不同的血清饑餓時間來誘導(dǎo)供體細(xì)胞進(jìn)入G0／G1期，也取得了不錯的試驗結(jié)果［10，11］，但很少將血清饑餓濃度、饑餓時間及細(xì)胞傳代階段與細(xì)胞周期的同步化做深入的關(guān)聯(lián)分析研究。該試驗研究了牛卵巢顆粒細(xì)胞制備過程中不同的血清濃度、血清饑餓時間以及體外培養(yǎng)時間對細(xì)胞周期同步化的影響。
1材料與方法
1．1材料
黃牛卵巢采自貴陽市某屠宰場；胎牛血清購自Gibco公司；DPBS、胰蛋白酶、DMEM、青霉素、鏈霉素、DMSO和透明質(zhì)酸購自Hyclone公司；RNaseA、碘化丙啶（PI）和TritonX-100購自南京凱基生物工程有限公司。
1．2牛卵巢顆粒細(xì)胞制備
黃牛卵巢從屠宰場收集后裝入加有100 IU/mL 鏈霉素和100 IU／mL青霉素的30℃ 的DPBS中，于4 h內(nèi)運(yùn)回實驗室。將卵巢帶回實驗室后以DPBS清洗2次，從卵巢表面抽取卵泡液，取2 mL卵泡液用等量的0．2％透明質(zhì)酸酶消化3 min，用DMEM離心洗滌（1 500 r／min，6 min）2次，然后用DMEM調(diào)整顆粒細(xì)胞的密度為1×106個／mL，將顆粒細(xì)胞移入加體積分?jǐn)?shù)10％FCS、2 mmol／L谷氨酰胺、100 IU／mL青霉素和鏈霉素的DMEM中進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞長至80％～90％時進(jìn)行細(xì)胞消化傳代培養(yǎng)。細(xì)胞消化用含0．1％胰蛋白酶和0．02％EDTA的消化液，在37．5℃下進(jìn)行。細(xì)胞冷凍保存液是含有20％（V／V） FCS和5％ DMSO的DMEM。顆粒細(xì)胞培養(yǎng)至第2、10和25代，在0．5％和0．05％ FCS濃度下分別處理2、3、4和5 d以誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞進(jìn)入G0／G1期。
1．3PI染色法檢測細(xì)胞周期
培養(yǎng)的牛卵巢顆粒細(xì)胞在37．5 ℃下用0．1％胰蛋白酶和0．02％ EDTA的消化液消化處理，然后移入5 mL離心管中用 DPBS離心洗滌（1 500 r／min，6 min）2次，再用DPBS調(diào)整細(xì)胞濃度，使每個離心管中細(xì)胞的數(shù)目達(dá)到1×105個。細(xì)胞在4 ℃ 條件下加入3 mL預(yù)冷的 70％ 乙醇進(jìn)行固定，過夜。固定后的細(xì)胞用提前預(yù)冷的DPBS洗滌離心2次，然后在每管中加入含有1 mg／mL RNase A 的0．5 mL PBS，在37 ℃的水浴中處理30 min。細(xì)胞染色是在4 ℃ 條件下以0．1 mg／mL PI 和0．1％ TritonX－100避光處理2 h。染色處理結(jié)束的細(xì)胞用流式細(xì)胞儀檢測其細(xì)胞周期。
1．4試驗方法
1．4．1培養(yǎng)時間對體外培養(yǎng)的牛卵巢顆粒細(xì)胞G0／G1期的影響探討牛卵巢顆粒細(xì)胞體外培養(yǎng)時間對其細(xì)胞周期的影響，分別將培養(yǎng)至第2、10和25代的牛卵巢顆粒細(xì)胞用0．5％ FCS饑餓誘導(dǎo)處理2 d，然后用PI染色法處理細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測不同培養(yǎng)時間細(xì)胞的細(xì)胞周期。
1．4．2不同濃度的FCS對牛卵巢顆粒細(xì)胞G0／G1期的影響探討血清饑餓在對誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的牛卵巢顆粒細(xì)胞進(jìn)入G0／G1期的影響，將體外培養(yǎng)至第5代的牛卵巢顆粒細(xì)胞分別用含0．5％ FCS和0．05％ FCS的培養(yǎng)液誘導(dǎo)處理2 d，對照組為10％ FCS。然后用PI染色法處理細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測不同試驗處理細(xì)胞的細(xì)胞周期。
1．4．3血清饑餓時間對牛卵巢細(xì)胞G0／G1期的影響探討血清饑餓時間對誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的牛卵巢顆粒細(xì)胞進(jìn)入G0／G1期的影響，將體外培養(yǎng)至第5代的牛卵巢顆粒細(xì)胞用含0．5％ FCS的培養(yǎng)液分別處理2、3、4和5 d，然后用PI染色法處理細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測不同處理細(xì)胞的細(xì)胞周期。
1．5統(tǒng)計分析
數(shù)據(jù)采用SPSS 11．5軟件分析，結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來表示。
2結(jié)果與分析
2．1培養(yǎng)時間對牛卵巢顆粒細(xì)胞G0／G1期的影響
將培養(yǎng)至第2、10和25代的牛卵巢顆粒細(xì)胞用0．5％ FCS饑餓誘導(dǎo)處理2 d，不同培養(yǎng)時間對其細(xì)胞周期的影響見表1。第2、10和25代牛卵巢顆粒細(xì)胞G0／G1期的百分比分別為82．6％、84．7％和83．8％，各組之間差異不顯著（P＞0．05）。
2．2不同濃度的FCS對牛卵巢顆粒細(xì)胞G0／G1期的影響
將體外培養(yǎng)至第5代的牛卵巢顆粒細(xì)胞用加有0．5％ FCS 和0．05％ FCS 的培養(yǎng)液誘導(dǎo)處理2 d，不同濃度的FCS對牛卵巢顆粒細(xì)胞進(jìn)入G0／G1期的影響見表2。由表2可知，0．5％ FCS和0．05％ FCS試驗組較對照組顯著提高了G0／G1期細(xì)胞的百分比（P＜0．05），但試驗組間差異不顯著（P＞0．05），兩者均獲得了比較高比例的G0／G1期細(xì)胞，但對照組（10％ FCS）僅有62．4％的細(xì)胞處于G0／G1期。
2．3血清饑餓時間對牛卵巢顆粒細(xì)胞G0／G1期的影響
將體外培養(yǎng)至第5代的牛卵巢顆粒細(xì)胞用加有0．5％ FCS的培養(yǎng)液分別處理2、3、4和5 d，饑餓時間對誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的牛卵巢顆粒細(xì)胞進(jìn)入G0／G1期的影響見表3。從表3中可以看出，隨著饑餓處理時間的增加，G0／G1期細(xì)胞的百分比呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢。饑餓處理5 d較2 d顯著提高了G0／G1期細(xì)胞的百分比（P＜0．05），饑餓處理2 d和5 d后的G0／G1期細(xì)胞的百分比分別為81．2％和87．6％。
3小結(jié)與討論
體細(xì)胞克隆技術(shù)中供體細(xì)胞的細(xì)胞周期和受體細(xì)胞核質(zhì)同步化是影響克隆效率的一個關(guān)鍵因素。供體細(xì)胞處于G0／G1階段有益于供體細(xì)胞和受體細(xì)胞的核質(zhì)同步化以及重構(gòu)胚的再程序化，而且能夠正常的濃縮染色體，在第一次細(xì)胞分裂的末期維持正常的染色體倍數(shù)［12］。在長期的研究中，人們采用了幾種不同的研究方法得到處于G0／G1階段的供體細(xì)胞［13，14］。在供體細(xì)胞的細(xì)胞周期同步化中，人們常以血清饑餓誘導(dǎo)供體細(xì)胞進(jìn)入G0／G1期。在牛成纖維細(xì)胞的研究中，通過0．05％濃度的血清誘導(dǎo)供體細(xì)胞取得了成功，同時通過延長低濃度血清誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞的時間，提高了G0／G1階段細(xì)胞的比例［15］。在當(dāng)前的研究中，0．5％和0．05％濃度的FCS在誘導(dǎo)牛卵巢顆粒細(xì)胞獲得高比例G0／G1期細(xì)胞方面沒有顯著差異，但0．5％和0．05％的FCS較10％的FCS顯著提高了牛卵巢顆粒細(xì)胞G0／G1期細(xì)胞的比例。這表明低濃度的血清誘導(dǎo)可以提高牛卵巢顆粒細(xì)胞G0／G1期的比例，但不同水平的低濃度血清對誘導(dǎo)牛卵巢顆粒細(xì)胞進(jìn)入G0／G1期沒有影響。結(jié)合以前的研究報道和本試驗的結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)并非血清饑餓就可以誘導(dǎo)體細(xì)胞獲得高比例的G0／G1期，這中間除了有不同實驗室工作環(huán)境和操作工藝存在差別的原因外，可能還與細(xì)胞類型及細(xì)胞來源有關(guān)。本研究中，通過延長0．5％濃度FCS對牛卵巢顆粒細(xì)胞的誘導(dǎo)時間，發(fā)現(xiàn)饑餓處理5 d的牛卵巢顆粒細(xì)胞較處理2 d的牛卵巢顆粒細(xì)胞均獲得了較高的G0／G1期細(xì)胞百分比。在對牛成纖維細(xì)胞的血清饑餓誘導(dǎo)研究中有和本試驗的結(jié)果基本一致，研究人員將血清饑餓的時間延長至14 d，得到了高比例的G0／G1期牛成纖維細(xì)胞［16］。以前的研究和我們的試驗結(jié)果說明通過延長血清饑餓的時間同樣可以獲得高比例的G0／G1期供體細(xì)胞。
在體細(xì)胞克隆研究中，人們發(fā)現(xiàn)Dolly的端粒長度明顯短于同齡羊，而與供體乳腺細(xì)胞的端粒長度相當(dāng)。這就提出了一個問題，體細(xì)胞克隆動物是否會遺傳供體核縮短了的端粒給后代，從而導(dǎo)致過早衰老。但之后幾年大量的研究表明，端粒復(fù)原存在于大部分克隆動物中，端?？s短可能不是造成克隆動物高死亡率的最主要原因。但在供體細(xì)胞體外制備過程中，人們又在擔(dān)心體外長期培養(yǎng)的細(xì)胞可能會給供體細(xì)胞本身和重構(gòu)胚體外培養(yǎng)帶來負(fù)面影響。而且有人認(rèn)為供體細(xì)胞衰老對重構(gòu)胚的發(fā)育潛能有影響，所以通常選擇體外培養(yǎng)短期階段的體細(xì)胞進(jìn)行克?。?7］。但大量的研究也表明，體外長期培養(yǎng)的細(xì)胞在重構(gòu)胚構(gòu)建及重構(gòu)胚發(fā)育方面優(yōu)于短期培養(yǎng)的細(xì)胞［18］。在本試驗中，培養(yǎng)至第2、10和25代的牛卵巢顆粒細(xì)胞均獲得了相近比例的G0／G1期細(xì)胞。這表明體外培養(yǎng)的牛卵巢顆粒細(xì)胞是否衰老對通過血清饑餓誘導(dǎo)細(xì)胞獲得G0／G1期細(xì)胞的比例沒有影響。因此，在牛卵巢顆粒細(xì)胞制備用作供體細(xì)胞的研究中，血清饑餓誘導(dǎo)可以提高細(xì)胞G0／G1期的比例，但不同水平的低濃度血清對誘導(dǎo)牛卵巢顆粒細(xì)胞進(jìn)入G0／G1期沒有影響，延長饑餓誘導(dǎo)的時間可以提高G0／G1期細(xì)胞的比例；體外傳代時間對牛卵巢顆粒細(xì)胞G0／G1期細(xì)胞比例的影響不顯著。
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【關(guān)鍵詞】 血管緊張素Ⅱ; 動脈粥樣硬化; 血管平滑肌細(xì)胞
【Abstract】 AngiotensinⅡ（AngII）has growth factor and cytokine-like properties . It plays an important role in the developement of atherosclerosis (AS). The effects of promoting migration， proliferation， apoptosis， phenotype translation and promoting the secretion and expression of many kinds of pro-inflammatory cytokines， growth factors and extracellular matrix proteins to vascular smooth muscle cells(VSMCs) in the progress of antherosclerosis are reviewed in this article.
【Key words】 angiotensinⅡ; atherosclerosis;vascular smooth muscle cell
動脈粥樣硬化（AS）是由一系列細(xì)胞及分子參與的炎癥反應(yīng)性疾病。血管平滑肌細(xì)胞（VSMCs）的活化、遷移與增殖是動脈粥樣硬化病變發(fā)展的必要條件［1］。 血管平滑肌細(xì)胞是動脈中膜的主要組成成分，在動脈硬化早期，在眾多生長因子和細(xì)胞因子作用下，其從血管中膜遷移至內(nèi)膜，進(jìn)而發(fā)生表型轉(zhuǎn)化并增殖，其自身也可合成多種細(xì)胞因子及生長因子，還可攝取脂質(zhì)成為肌源性泡沫細(xì)胞。當(dāng)脂質(zhì)過分充滿細(xì)胞時，細(xì)胞破裂，脂質(zhì)在細(xì)胞外側(cè)沉積，細(xì)胞本身死亡，而成為斑塊中的纖維成分。其病理變化伴隨著動脈粥樣硬化的發(fā)生與發(fā)展。最終使血管內(nèi)膜增厚，導(dǎo)致管腔狹窄。
血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）是腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（RAS）中主要的活性肽產(chǎn)物。近年來，大量的研究表明，Ang Ⅱ參與了動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展［2］。Ang Ⅱ可引起血管收縮，導(dǎo)致高血壓，繼發(fā)性引起AS。另外，Ang Ⅱ通過若干細(xì)胞內(nèi)信號傳遞系統(tǒng)的活化，通過內(nèi)皮損害或炎癥狀態(tài)獨立于血壓促進(jìn)AS的發(fā)生。在AS的過程中，Ang Ⅱ有促進(jìn)VSMCs遷移、增殖和凋亡的作用，并可促進(jìn)其表達(dá)與分泌多種炎癥細(xì)胞因子、生長因子和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，進(jìn)而促進(jìn)斑塊形成。其在動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用。
1 血管緊張素Ⅱ及其受體的生物學(xué)功能
自從1898年發(fā)現(xiàn)腎素后，RAS系統(tǒng)對心血管系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用已被認(rèn)識100多年。AngⅡ是RAS的主要活性成分，主要由循環(huán)或局部的血管緊張素原或血管緊張素Ⅰ（AngⅠ）在水解酶作用下水解產(chǎn)生。生成Ang Ⅱ的途徑有兩種：一種是血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(angiotensin converting enzyme， ACE) 途徑；另一種是糜酶(chy2mase)依賴的旁路途徑。前者是生成Ang Ⅱ的經(jīng)典途徑，主要生成循環(huán)的Ang Ⅱ，而后者是局部Ang Ⅱ生成的主要途徑。AngⅡ不僅具有強(qiáng)烈的縮血管、升高動脈血壓的作用，而且通過其受體在影響細(xì)胞生長、增殖、凋亡和調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng) 、組織纖維化、凝血機(jī)制等方面起著重要病理生理作用。有證據(jù)表明，粥樣硬化的動脈ACE表達(dá)增加，局部AngⅡ的生成增多， AngⅡ通過增多氧化自由基，促進(jìn)黏附分子的表達(dá)，誘發(fā)炎癥過程，在AS的進(jìn)展中起重要作用［3］。另外在VSMCs、心肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞以及多種上皮來源細(xì)胞中， AngⅡ還具有促進(jìn)細(xì)胞生長的作用。其促進(jìn)細(xì)胞生長的機(jī)制與血小板衍生生長因子（PDGF）、c-myc、胰島素樣生長因子（insulin like growth factor-1，IGF-1）和轉(zhuǎn)化生長因子等作用有關(guān)。
AngⅡ通過其受體發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，其受體可分為血管緊張素1型受體(AT1R)、血管緊張素2型受體（AT2R)、血管緊張素3型受體（AT3R)和血管緊張素4型受體（AT4R)四種亞型，目前了解較多的是AT1R型和AT2R型， AT1R又進(jìn)一步分為AT1aR 和AT1bR兩個亞型。AT1R主要分布在于血管、心、腦、腎、肝臟等組織器官中 ，而AT2R主要存在于胎兒組織、腎上腺髓質(zhì)、成人的腦組織，子宮、卵泡中也可見到。AT1R和AT2R均屬于G蛋白耦聯(lián)受體。研究表明， AT1R通過Gq激活磷脂酶C促進(jìn)1， 4， 5 - 三磷酸肌醇( IP3 )和二酰甘油產(chǎn)生及Ca2+代謝和蛋白激酶C的激活或通過酪氨酸蛋白激酶途徑激活絲裂原活化蛋白激酶等機(jī)制，完成AngⅡ收縮血管、促進(jìn)細(xì)胞增殖等功能。在成熟組織中，幾乎所有已知的AngⅡ作用都是通過AT1R所介導(dǎo)的。這些作用包括:血管平滑肌收縮、醛固酮的分泌、致渴反應(yīng)， 腎重吸收鈉， 升壓及心動過速反應(yīng)。而AT2R通過與第三個胞內(nèi)環(huán)激活Gi和酪氨酸磷酸酶通路，滅活胞外信號調(diào)節(jié)激酶而實現(xiàn)其抑制生長的作用。AT2R主要表達(dá)于胎兒，因此其生物學(xué)活性主要表現(xiàn)為: （1）在胎兒腎中誘導(dǎo)細(xì)胞分化; （2）抑制細(xì)胞肥大、增殖，誘導(dǎo)凋亡。目前研究表明AT1R和AT2R在細(xì)胞增長和增殖、血管張力、血管腎素的釋放等方面作用相反。但是，有關(guān)ATR的生物學(xué)特性的具體機(jī)制還不完全清楚，有待進(jìn)一步的研究。
2 血管緊張素Ⅱ?qū)用}粥樣硬化中血管平滑肌細(xì)胞的作用
AS中，Ang Ⅱ可促進(jìn)VSMCs遷移、增殖及其表型轉(zhuǎn)化，并有促進(jìn)VSMCs各種炎性細(xì)胞因子、生長因子及細(xì)胞外基質(zhì)蛋白表達(dá)與分泌的作用，致AS斑塊逐漸形成。
2．1 Ang Ⅱ?qū)SMCs表型轉(zhuǎn)化、遷移及增殖的作用 VSMCs可分為收縮型和合成型兩種表型。正常成人動脈血管內(nèi)的平滑肌細(xì)胞以收縮型為主，主要功能是維持血管的彈性和收縮血管，而合成型分化程度低或處于未分化狀態(tài)，合成和分泌基質(zhì)蛋白能力強(qiáng)，主要功能是增殖、遷移入內(nèi)膜和合成基質(zhì)，主要位于胚胎中期血管或病理血管中［4］。Ang Ⅱ可促進(jìn)VSMCs由收縮型轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣尚?，并獲得遷移、增殖和合成、分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的能力，嚴(yán)重時引發(fā)血管重構(gòu)，促進(jìn)AS病變的發(fā)生與發(fā)展［5］。
景濤等［6］研究發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)的大鼠VSMCs在基礎(chǔ)狀態(tài)下也存在AT1R的表達(dá)，給予Ang Ⅱ刺激后，在短時間內(nèi)迅速使VSMCs內(nèi)AT1R表達(dá)上調(diào)，刺激大鼠VSMCs發(fā)生跨膜遷移并使VSMCs內(nèi)肌動蛋白組裝為整齊的應(yīng)力纖維網(wǎng)；而預(yù)先給予AT1R拮抗劑CV-11974處理后再給予Ang Ⅱ，結(jié)果使AT1R表達(dá)下調(diào)。AT1R拮抗劑CV-11974可明顯抑制VSMCs內(nèi)應(yīng)力纖維絲形成，并呈濃度依賴性抑制AngⅡ介導(dǎo)的VSMCs遷移；AT2R拮抗劑PD123319對VSMCs應(yīng)力纖維絲形成和VSMCs跨膜遷移細(xì)胞數(shù)均無顯著的影響，同時阻斷AT1R和AT2R后VSMCs的跨膜遷移細(xì)胞數(shù)及應(yīng)力纖維絲形成情況與單獨阻斷AT1R時差異無顯著性。提示不同濃度的Ang Ⅱ可能是通過AT1R介導(dǎo)來調(diào)節(jié)VSMCs內(nèi)肌動蛋白組裝成應(yīng)力纖維網(wǎng)。從而發(fā)揮其介導(dǎo)VSMCs遷移的生物學(xué)效應(yīng)。而AT2R在生物學(xué)功能上并無與AT1R相拮抗的作用。Yasunari K等［7］通過實驗發(fā)現(xiàn)壓力升高可使Ang Ⅱ介導(dǎo)的冠狀動脈平滑肌細(xì)胞遷移增加。因而高血壓是AS的危險因素之一。
Ang Ⅱ以一種有效的生長因子促進(jìn)VSMCs增殖。其通過與G蛋白耦聯(lián)的AT1R作用，激活細(xì)胞內(nèi)的多種信號傳導(dǎo)路徑，達(dá)到促進(jìn)VSMCs增殖的目的。Q.N.Diep等［8］通過實驗發(fā)現(xiàn)，Ang Ⅱ引起的VSMCs增殖能被抑制劑氯沙坦抑制，而用AT2R抑制劑卻能引起更明顯的主動脈VSMCs增殖。此實驗結(jié)果表明AT1R具有介導(dǎo)Ang Ⅱ促VSMCs增殖的作用，而AT2R并不具有此作用。實驗中用AT2R抑制劑后使更多的Ang Ⅱ與AT1R結(jié)合，致使Ang Ⅱ的促增殖作用更顯著。
2．2 Ang Ⅱ?qū)SMCs炎性細(xì)胞因子表達(dá)與分泌的作用 對AS斑塊的免疫學(xué)研究發(fā)現(xiàn)， Ang Ⅱ可刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞、斑塊內(nèi)的巨噬細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞 （SMC）、成纖維細(xì)胞等產(chǎn)生多種炎性細(xì)胞因子，促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生與發(fā)展。對于VSMCs，Ang Ⅱ可通過其表面受體介導(dǎo)，進(jìn)而活化細(xì)胞內(nèi)若干信號傳導(dǎo)系統(tǒng)，促進(jìn)單核細(xì)胞趨化蛋白1（MCP1）、IL-6、IL-18Rα等多種炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，參與AS發(fā)生發(fā)展的多個階段。
在AS發(fā)生、發(fā)展的多個階段，促進(jìn)斑塊的不穩(wěn)定及破裂過程中，MCP1均起了重要作用。Chen等［9］證實AngⅡ可通過 AT1R介導(dǎo)機(jī)制刺激培養(yǎng)的鼠大動脈平滑肌細(xì)胞（RASMCs） 內(nèi) MCP1 的基因表達(dá)， 并且這種誘導(dǎo)依賴于對氧化還原反應(yīng)敏感信號轉(zhuǎn)遞事件，包括 NADH/NADPH氧化酶的激活、H2O2產(chǎn)生等，這種誘導(dǎo)同樣依賴于蛋白酪氨酸磷酸化和絲裂原活性蛋白激酶（MAPK）活性的級聯(lián)放大作用。Funakoshi 等［10］發(fā)現(xiàn) Rho 激酶也參與介導(dǎo)AngⅡ誘導(dǎo)的鼠平滑肌細(xì)胞對MCP1表達(dá)的過程。Binlin等［11］證實AngⅡ通過抑制核糖核酸酶活性增加VSMCs MCP1 mRNA穩(wěn)定性及其表達(dá)。
促炎細(xì)胞因子IL-6有誘導(dǎo)VSMCs遷移、增殖的作用，可加速AS炎癥反應(yīng)，并促進(jìn)斑塊向不穩(wěn)定的方向發(fā)展。Ang Ⅱ通過AT1R啟動VSMCs內(nèi)信號傳遞系統(tǒng)，并呈劑量依賴性地促進(jìn)IL-6表達(dá)［12］。有實驗表明，Ang Ⅱ通過核因子kB、cAMP應(yīng)答元件結(jié)合蛋白和組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶P300和SRC-1介導(dǎo)的細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶依賴的組蛋白乙?；饔么龠M(jìn)IL-6mRNA表達(dá)［13］。Ruwen Cui等［14］首先提出Ang Ⅱ可通過Rho-phospho-Ser536RelA途徑調(diào)節(jié)VSMCs IL-6表達(dá)。Ang Ⅱ也可促進(jìn)VSMCs表面IL-18Ra表達(dá)，從而強(qiáng)化IL-18誘導(dǎo)炎癥基因的表達(dá)，Ang Ⅱ與IL-18之間信號通路的交互作用可增強(qiáng)VSMCs炎癥基因的表達(dá)，使AS進(jìn)一步惡化［15］。Ang Ⅱ刺激炎性細(xì)胞產(chǎn)生分泌細(xì)胞因子，它們共同刺激肝細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生和分泌CRP，CRP也可反作用于AngⅡ，影響AngⅡ的作用。Wang等［16］研究發(fā)現(xiàn)CRP可以上調(diào)VSMCs表面AT1R的表達(dá)，從而協(xié)同AngⅡ的生物學(xué)效應(yīng)。AngⅡ促進(jìn)VSMCs表達(dá)與分泌炎癥介質(zhì)的作用伴隨著AS的發(fā)生與發(fā)展。
2．3 AngⅡ?qū)SMCs生長因子及細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的表達(dá)與分泌的作用 AS中，AngⅡ可促進(jìn)VSMCs表達(dá)及分泌多種生長因子，如TGF-β1、血小板源性生長因子（PDGF）、胰島素樣生長因子1（IGF-1）、表皮生長因子（HB-EGF）、成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）、epiregulin、結(jié)締組織生長因子（CTGF）等。TGF- β1 對VSMCs具有生長抑制或誘導(dǎo)其增生的雙向調(diào)節(jié)作用，低濃度起促進(jìn)作用，高濃度起抑制作用；而其他由VSMCs分泌的生長因子有協(xié)同AngⅡ促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用。有研究表明PDGF可通過促進(jìn)NOR1表達(dá)介導(dǎo)平滑肌細(xì)胞的增殖［17］，而且PDGF可促進(jìn)VSMCs表達(dá)與分泌bFGF和激活成纖維細(xì)胞生長因子1型受體(FGFR-1)，通過FGFR-1對ERK的持久激活，達(dá)到促進(jìn)細(xì)胞增殖的目的［18］。AngⅡ具有促進(jìn)VSMCs發(fā)生表型轉(zhuǎn)化的重要作用。當(dāng)VSMCs發(fā)生表型轉(zhuǎn)化后，其可表達(dá)及分泌大量的細(xì)胞外基質(zhì)，纖維連接蛋白、膠原及彈力蛋白等合成增加，這些細(xì)胞外微環(huán)境的改變將更有利于細(xì)胞的遷移及增殖。同時VSMCs分泌的部分生長因子，也有促進(jìn)胞外基質(zhì)合成與聚集的作用。 例如TGF-β1就具有調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）蛋白，增加纖連蛋白(FN)、蛋白聚糖和膠原蛋白合成，阻滯基質(zhì)蛋白降解的作用［19］。因而TGF-β1在調(diào)節(jié)AS斑塊的穩(wěn)定性方面起著舉足輕重的作用。另外有研究表明，AngⅡ也可通過p38MAPK依賴途徑而非TGF-β1依賴機(jī)制激活Smad路徑，刺激VSMCs合成細(xì)胞外基質(zhì)［20］。
2．4 AngⅡ?qū)SMCs凋亡的作用 AngⅡ的AT1R和AT2R兩型受體均有介導(dǎo)VSMCs凋亡的作用。Hong Song等［21］通過TUNEL染色發(fā)現(xiàn)AngⅡ作用的VSMCs組比對照組細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯增加，AngⅡ加AT1R抑制劑氯沙坦組比AngⅡ組細(xì)胞凋亡指數(shù)增加，而AngⅡ加AT2R抑制劑PD-123319組比AngⅡ組細(xì)胞凋亡指數(shù)減少，但與對照組比較增加，AngⅡ加兩型受體抑制劑氯沙坦和PD-123319組細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯比前幾組低，此結(jié)果表明，AngⅡ?qū)T1R和AT2R激活均有介導(dǎo)VSMCs凋亡的作用，而AT2R介導(dǎo)VSMCs凋亡的作用更明顯。而Q.N.Diep等［8］通過實驗證實AngⅡ通過AT1R介導(dǎo)的增殖比凋亡作用更顯著。AngⅡ可促進(jìn)VSMCs表達(dá)TGF-β1，而TGF-β1可通過ALK/smads途徑調(diào)節(jié)VSMCs的凋亡［22］。那么AngⅡ是否有依賴于TGF-β1的信號途徑促進(jìn)細(xì)胞凋亡呢？已有證據(jù)表明AngⅡ通過TGF-β1依賴途徑促進(jìn)腎小管細(xì)胞凋亡［23］。Santiago等［24］用TGF-β1抗體或ALK抑制劑作用于培養(yǎng)的VSMCs，結(jié)果并不能抑制AngⅡ誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，并進(jìn)一步證實AngⅡ通過AT1R激活p38MAPK途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，不依賴于TGF-β1/ ALK/ smads 路徑。
Emilio Ruiz等［25］證實細(xì)胞內(nèi)攝的AngⅡ?qū)SMCs凋亡也具有重要作用。近期有研究表明， AngⅡ所致的VSMCs凋亡與AKT磷酸化抑制和胞膜fasL表達(dá)增加有關(guān)［26］?？赡芤驗檫@兩種信號傳導(dǎo)路徑與AngⅡ細(xì)胞內(nèi)攝有關(guān)，而內(nèi)攝的AngⅡ可致最終的胞核內(nèi)DNA裂解。AngⅡ的細(xì)胞內(nèi)攝是通過AT1R介導(dǎo)的，β-抑制蛋白通過AT1R胞質(zhì)網(wǎng)格結(jié)合蛋白與受體連接介導(dǎo)AT1R- AngⅡ復(fù)合體內(nèi)攝，參與 AngⅡ的部分內(nèi)攝作用［27］。
總而言之，AngⅡ有調(diào)節(jié)VSMCs增殖與凋亡的作用，但在VSMCs表面主要表達(dá)AT1R，AT2R只有少量表達(dá)，因而AngⅡ誘導(dǎo)細(xì)胞增殖比凋亡的作用顯著，最終的結(jié)果是誘導(dǎo)VSMCs增殖，血管壁逐漸增厚，致管腔狹窄。
3 展望
綜上所述，AngⅡ可通過VSMCs表面受體介導(dǎo)，激活細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜的信號傳導(dǎo)系統(tǒng)，促進(jìn)細(xì)胞遷移、增殖、凋亡及表型轉(zhuǎn)化，并有促進(jìn)細(xì)胞表達(dá)及分泌多種生長因子、炎性細(xì)胞因子及細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的作用，促進(jìn)AS斑塊的形成。當(dāng)然，AngⅡ?qū)⑴cAS的多種細(xì)胞都有刺激作用，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生病理生理變化，促進(jìn)病變的發(fā)生與發(fā)展。雖然對AngⅡ與AS關(guān)系的研究越來越深入，但仍有很多問題尚待解決：（1）目前研究AngⅡ的作用主要集中在其與AT1R和AT2R上，而其與AT3R和 AT4R的作用尚未明確；（2）AngⅡ在體內(nèi)可分解成AngⅢ和AngⅣ等一系列的代謝產(chǎn)物，它們與受體的作用及機(jī)制有待進(jìn)一步明確；（3）局部的AngⅡ?qū)S的病理生理作用已有很多相關(guān)研究，但循環(huán)的AngⅡ在AS發(fā)生與發(fā)展中的作用及機(jī)制有待探討；（4）AngⅡ?qū)⑴cAS多種細(xì)胞的作用及分子機(jī)制有待進(jìn)一步完善；（5）AngⅡ與TGF-β1、IL及ox-LDL等一些參與AS病理過程因子間的交互對話作用有待進(jìn)一步明確。深入了解AngⅡ?qū)S的病理生理作用及其分子機(jī)制，對進(jìn)一步研究AS形成過程具有重要意義，并為臨床抗AS用藥提供科學(xué)依據(jù)，將為臨床AS的有效治療提供新思路。
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摘 要：目的：觀察丹參對高膽固醇血癥患者內(nèi)皮祖細(xì)胞(endotlial progeIlitor cells，EPCs)的保護(hù)作用。方法：年齡性別匹配的健康志愿者及高膽固醇血癥患者各6例入選研究，各取空腹外周血20mL，采用密度梯度離心法分離單個核細(xì)胞，貼壁選擇法行EPcs培養(yǎng)，以健康志愿者為對照組，各高膽固醇血癥患者血樣一分為二，分別為高膽固醇組及丹參組，丹參組培養(yǎng)時另添加復(fù)方丹參注射液10μg/mL，采用流式細(xì)胞術(shù)、倒置顯微鏡、MIT法、Boyden小室等分別觀察各組EPC8數(shù)量、集落形成能力、增殖能力、黏附能力及遷移能力。結(jié)果：高膽固醇血癥患者外周血EPCs數(shù)量較對照組顯著下降[(6.13±0.84)vs(24.53±3.67)，P＜0.01]，且其克隆形成能力、增殖能力、黏附能力及遷移能力也顯著降低，培養(yǎng)時添加復(fù)方丹參注射液使丹參組克隆形成能力、增殖能力、黏附能力及遷移能力較高膽固醇組顯著提高，但低于對照組，其中黏附能力及遷移能力雖仍較對照組低。但無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。結(jié)論：高膽固醇血癥患者外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量下降，功能受損，復(fù)方丹參注射液對高膽固醇血癥患者外周血培養(yǎng)的內(nèi)皮祖細(xì)胞功能有保護(hù)作用。
關(guān)鍵詞：丹參；內(nèi)皮祖細(xì)胞；細(xì)胞培養(yǎng)；高膽固醇血癥
隨著內(nèi)皮祖細(xì)胞(endotllelial progenitor cells，EPCs)的研究逐步深入，EPCs和動脈粥樣硬化、冠心病的關(guān)系引起研究者極大興趣。EPCs促進(jìn)血管新生，參與體內(nèi)血管內(nèi)膜損傷的修復(fù)過程，在動脈粥樣硬化早期預(yù)防中起重要作用。高膽固醇血癥是動脈粥樣硬化、冠心病的重要危險因素。研究發(fā)現(xiàn)高膽固醇血癥患者外周血EPCs數(shù)量減少，功能受損。因此，尋找有效藥物動員高膽固醇血癥患者體內(nèi)EPCs、增加外周血EPCs數(shù)量并改善其功能成為動脈粥樣硬化、冠心病防治的一個研究新方向。丹參具有保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞，改善內(nèi)皮功能的作用。丹參對于與內(nèi)皮細(xì)胞同一譜系的EPCs是否有保護(hù)作用呢?本實驗觀察高膽固醇血癥患者外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞的變化及丹參的作用，以進(jìn)一步明確丹參的作用機(jī)制。
1 材料
纖維連接蛋白購自Boche公司，VEGF購自PeproTechEC公司，Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫組化試劑盒購自武漢博士德生物工程公司，MTr購自華美生物工程公司PE-CD34購自CALTAG LABORATORIES，F(xiàn)ITC-VE-Cadherin購自Bender systemTM公司，PE-VEGFR-2及FITC-ACl33購自R&D systems，胎牛血清、胰酶、M199、ECGS、Hank's液、PBS均購自GIBCO公司，DiI-ac-LDL購自Molecularprobe公司，Boyden小室為江蘇海門麒麟醫(yī)用儀器廠生產(chǎn)，復(fù)方丹參注射液為貴州神奇制藥生產(chǎn)，其余為市售試劑。
2 方法
2．1 實驗分組健康志愿者及高膽固醇血癥患者各6例入選研究，高膽固醇血癥患者的診斷參照1997年中華心血管病學(xué)分會制訂的《血脂異常防治建議》，兩組年齡、性別匹配。剔除外傷、潰瘍、視網(wǎng)膜病、近期外科手術(shù)、炎癥、腫瘤等影響內(nèi)皮祖細(xì)胞疾病的患者，近3個月無急性心肌梗死、心絞痛發(fā)生。各取空腹外周血20mL，采用密度梯度離心法分離單個核細(xì)胞，以健康志愿者為對照組，各高膽固醇血癥患者血樣一分為二，分別為高膽固醇組及丹參組。
2．2 人外周血EPCs培養(yǎng)，將分離到的單個核細(xì)胞，以5×106/cm2密度接種于包被有纖維連接蛋白的24孔培養(yǎng)皿中，每組每份血樣各6mm，每皿加入lmL包含有20％胎牛血清、青霉素(100U/mL)及鏈霉素(100U/mL)的M199，丹參組每皿添加復(fù)方丹參注射液101μg/mL，其余各組添加等量培養(yǎng)液，置37℃、5％CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3天后，洗去未貼壁細(xì)胞，如前添加培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)待用。
2．3 EPCs鑒定培養(yǎng)細(xì)胞以0.25％胰酶消化后，制成1×106/mL的單個細(xì)胞懸液，加入熒光標(biāo)記的CD34、VE-Cadherin、VEGFR-2或ACl33 10μL(1mg/mL)，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞CD34、VE-Cadherin、VEGFR-2及ACl33的表達(dá)。為驗證培養(yǎng)細(xì)胞吞噬DiI-ac-LDL，將DiI-ac-LDL以2.4μg/mL的終劑量加入培養(yǎng)液，與細(xì)胞避光共孵育4h，洗去培養(yǎng)液后熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光。以不加DiI-ac-LDL的同批培養(yǎng)細(xì)胞作空白對照。陰性對照采用GSC7901(胃癌細(xì)胞株)。培養(yǎng)細(xì)胞Ⅷ因子相關(guān)抗原的檢測采用免疫組化法，空白對照不加一抗，陰性對照采用GSC7901。
2．4 外周血EPCs數(shù)量檢測采用本實驗室方法，取各組分離的外周血單個核細(xì)胞各1/10，制成1×106/mL的單個細(xì)胞懸液，加入熒光標(biāo)記的CD34及ACl33各10μL(1mg/mL)，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞CD弘及ACl33的表達(dá)，以雙陽性細(xì)胞為EPCs，QIleBt軟件分析計數(shù)。
2．5 克隆形成能力檢測培養(yǎng)第4天，倒置顯微鏡下可觀察到典型細(xì)胞團(tuán)，中間為大量的圓形細(xì)胞，層層疊疊，外周為紡錘形細(xì)胞，向外擴(kuò)散，以大于50個細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)為一個集落，在培養(yǎng)皿上下左右中5個方位各隨機(jī)取一個視野(×40)計數(shù)集落數(shù)，取均值。
2．6 EPCs黏附能力檢測用0.25％胰蛋白酶消化收集貼壁細(xì)胞，懸浮在500μL培養(yǎng)液中，計數(shù)，然后將同等數(shù)目的EPCs接種在包被纖維連接蛋白的培養(yǎng)板，在37℃培養(yǎng)30min，洗去未貼壁細(xì)胞，隨機(jī)選取10個視野(×200)，倒置顯微鏡下計數(shù)黏附細(xì)胞數(shù)。
2．7 EPCs遷移能力檢測如上述收集貼壁細(xì)胞并計數(shù)。將100IIL培養(yǎng)液和VEGF(50ng/mL)加入改良的Boy-den小室的下室，將2×104EPCs懸浮在15μL培養(yǎng)液注入上室，培養(yǎng)24h，刮去濾膜上面的未移動細(xì)胞，用甲醇固定，Giemsa染色，隨機(jī)選擇5個顯微鏡視野(×200)計數(shù)遷移到低層的細(xì)胞。
2．8 EPCs增殖能力試驗如上述收集貼壁細(xì)胞并計數(shù)。再將等量EPCs接種到包被纖維連接蛋白的96孔培養(yǎng)板，每孔加10μL MTI(5me/mL)，培養(yǎng)4h后，吸棄上清液，再加入二甲基亞砜(150μL/孔)，于微量振蕩器充分振蕩10min，置酶標(biāo)儀測OD490值。
2．9統(tǒng)計學(xué)處理方法采用單因素方差分析比較各組均數(shù)，P＜0.05為有顯著性差異。
3 結(jié)果
3．1 EPCs鑒定培養(yǎng)3天洗去不貼壁細(xì)胞及碎片后，可見典型細(xì)胞集落：呈白色半透明，略高于培養(yǎng)平面，中間為大量的圓形細(xì)胞，層層疊疊，外周為紡錘形細(xì)胞，向外擴(kuò)散。6天后流式細(xì)胞儀分析示細(xì)胞表達(dá)CD34，VE-Cadherin，VEGFR-2及ACl33。熒光顯微鏡檢顯示：隨培養(yǎng)時間的延長，越來越多的細(xì)胞吞噬DiI-ac-LDL，顯微鏡下激發(fā)紅色熒光，空白對照及陰性對照均無熒光。培養(yǎng)2周后，Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫組化陽性，胞漿呈棕色，空白對照及陰性對照不顯棕色。
3．2高膽固醇血癥患者外周血EPCs數(shù)量的變化與對照組相比，高膽固醇組外周血EPCs數(shù)量顯著下降[(24.53±3.67) vs (6.14±0.84)，P＜0.01]。
3．3高膽固醇血癥患者外周血EPCs功能的變化及丹參的影響見表1，與對照組相比，高膽固醇組外周血EPCs集落形成能力、增殖能力、黏附能力及遷移能力均顯著下降(均P＜0.01)；培養(yǎng)液中添加復(fù)方丹參注射液10μg/mL，使丹參組EPCs集落形成能力、增殖能力、黏附能力及遷移能力較高膽固醇組均顯著提高，其中黏附細(xì)胞數(shù)及遷移細(xì)胞數(shù)雖仍較對照組低[分別為：(14.79±1.93)vs(20.61±8.41)及(19.41±1.90) vs (22.27±7.98)，均
P＞0.05，但 無統(tǒng)計學(xué)差異。
4 討論
眾所周知，高膽固醇血癥是動脈粥樣硬化、冠心病的重要危險因素：ox-LDL通過對內(nèi)皮細(xì)胞的氧化損傷、誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡等機(jī)制引起內(nèi)皮功能障礙，從而啟動動脈粥樣硬化進(jìn)程。最近的資料表明，高膽固醇血癥不僅造成內(nèi)皮細(xì)胞損傷，同樣影響內(nèi)皮祖細(xì)胞的數(shù)量和功能。2003年，Hill等在研究中觀察了45例具有心血管危險因素但沒有患心血管疾病的患者外周血EPCs數(shù)量變化，發(fā)現(xiàn)血膽固醇水平與EPCs數(shù)量呈負(fù)相關(guān)。隨后，朱軍慧等發(fā)現(xiàn)，高膽固醇血癥患者不僅外周血EPCs數(shù)量明顯減少，EPCs數(shù)量與血總膽固醇水平和低密度脂蛋白膽固醇水平呈反向線性關(guān)系，而且Ⅱ，cs的黏附能力、遷移能力、增殖能力也明顯受損。進(jìn)一步的研究顯示ox-LDL是高膽固醇血癥患者內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量功能改變的主要原因。本研究結(jié)果顯示高膽固醇血癥患者內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量下降，功能受損，與國內(nèi)外研究相似。高膽固醇血癥(ox-LDL)導(dǎo)致EPCs數(shù)量減少和功能受損的確切機(jī)制尚不明確，目前認(rèn)為可能與下列因素有關(guān)：(1)ox-LDL直接引起EPCs損傷；(2)ox-LDL增加EPC的凋亡；(3)ox-LDL影響EPCs的分化和動員。
內(nèi)皮祖細(xì)胞是指出生后機(jī)體中存在的能特異性歸巢于血管損傷、血管新生部位并分化成內(nèi)皮細(xì)胞的一群干/祖細(xì)胞，參與體內(nèi)血管內(nèi)膜損傷的修復(fù)過程，在動脈粥樣硬化早期預(yù)防中起重要作用。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)冠心病病人循環(huán)中EPCs數(shù)量下降了近50％，遷移能力受損。因此，通過各種手段動員高膽固醇血癥患者的EPCs，提高其外周血EPC8數(shù)量，保護(hù)高膽固醇血癥患者的EPC8，恢復(fù)其功能，將大大降低高膽固醇血癥患者動脈粥樣硬化、冠心病的風(fēng)險。
1 資料與方法
1.1 一般資料 選擇2009年1月至2011年12月在我院血液凈化室89例長期維持 血液透析患者，男52例，女37例，年均21～79歲，平均年齡 53歲，原發(fā)性為慢性腎小球腎炎，高血壓腎損害，糖尿病腎病，藥物性腎損害，多囊腎等。
1.2 方法 常規(guī)血液透析結(jié)束后，拔去內(nèi)瘺穿刺針，用無菌壓迫條(由紗布折疊成的1.5×3×1 cm3大小的硬條)壓迫穿刺針眼，松緊適當(dāng)，30 min后逐漸放松，觀察有無出血及血管損傷情況，每次于透析結(jié)束24 h后將新鮮生土豆切成比瘀血硬結(jié)范圍寬1～2 cm,厚約0.5～1 cm大小的片狀，用膠布或繃帶固定土豆片，使土豆片緊貼皮膚，每3～4 h更換土豆片一次，每日3～4次，視治療范圍大小、所治療時間不等。
1.3 穿刺血管及周圍變化分型標(biāo)準(zhǔn) 透析結(jié)束穿刺針眼止血結(jié)束后，認(rèn)真觀察穿刺血管硬化及周圍硬結(jié)情況。①無痛型：穿刺血管彈性好，無疼痛，無紅腫，無硬結(jié)。②輕型：穿刺血管較硬，彈性降低，但無硬結(jié)。③中型：穿刺血管周圍出現(xiàn)硬結(jié)，直徑小于1 cm,有壓痛。④重型：穿刺部位周圍硬結(jié)直徑大于1 cm，觸痛明顯。一般于實施護(hù)理措施3～7 d后觀察判定結(jié)果。
1.4 觀察療效標(biāo)準(zhǔn) 痊愈：穿刺血管局部疼痛完全消失，周圍硬結(jié)完全消失，血管彈性恢復(fù)；有效：穿刺部位疼痛明顯緩解，血管變軟，周圍硬結(jié)開始變軟或明顯縮??；無效：癥狀如初，不見好轉(zhuǎn)。
2 結(jié)果
顯效81例，顯效率91%，有效8例，有效率9%，總有效率100%。
3 討論
維持性血液透析患者需要一條方便、耐用的血管通路，只有理想的血管通路才能保證有效的血液透析。臨床上患者必須使用16 g穿刺針才能保證充分的血流量，由于長期反復(fù)的穿刺，對血管的破壞性極大，使用與保護(hù)不當(dāng)會造成很多的并發(fā)性，影響動靜脈內(nèi)瘺的使用壽命。
土豆又名馬鈴薯、山藥蛋等，主要成分為B族維生素、維生素C、胡蘿卜素及茄定、茄堿、塊莖葛蘇等［2］。土豆中還含有龍葵堿，具有殺菌止癢，消炎消腫止痛等作用。因此在抑制炎癥的過程中，可使毛細(xì)血管通透性增加，促進(jìn)血液循環(huán)及皮膚新陳代謝。臨床報道土豆治療肌內(nèi)注射引起的硬結(jié)、靜脈輸注各種藥物引起的靜脈炎癥等均取得良好效果。
我院地處中原地區(qū)，經(jīng)濟(jì)欠發(fā)達(dá)，許多血液透析患者家處山區(qū)、農(nóng)村，雖有新型農(nóng)村合作醫(yī)療保險，但血液透析費(fèi)用較高，再加上多年的求醫(yī)問藥，對每一位因家庭困難透析不充分，綜合治療跟不上的患者而言，經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)恐怕是最根本的原因。土豆在我國種植面積較廣，且價格低廉，透析患者使用土豆片治療血管硬化及周圍硬結(jié)對皮膚無刺激，安全有效，且取材方便，操作簡單，無毒副作用，經(jīng)濟(jì)實用，患者更容易接受，值得臨床借鑒推廣。
參 考 文 獻(xiàn)
【摘要】 目的 對亞洲牛帶絳蟲成蟲延伸因子-1(elongation factor 1， EF-1)基因進(jìn)行克隆、表達(dá)和免疫學(xué)初步研究。方法 將亞洲牛帶絳蟲成蟲EF-1克隆到原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)中，在大腸桿菌BL-21/DE3中用異丙硫代-β-D半乳糖苷誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物通過十二烷基磺酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進(jìn)行鑒定，用鎳離子金屬螯合劑親和層析柱進(jìn)行純化，用蛋白印跡法(Western blotting)進(jìn)行免疫學(xué)分析。結(jié)果 PCR、雙酶切及DNA測序結(jié)果均表明重組質(zhì)粒pET-28a(+)-EF-1構(gòu)建成功。重組蛋白可被感染了亞洲牛帶絳蟲患者血清和豬血清識別，表明其具有免疫反應(yīng)性。結(jié)論 亞洲牛帶絳蟲成蟲EF-1基因可在原核表達(dá)系統(tǒng)中獲得具有免疫學(xué)活性的表達(dá)，為進(jìn)一步研究該蛋白的功能奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】 亞洲牛帶絳蟲；延伸因子-1；基因克隆；原核表達(dá)
ABSTRACT: Objective To clone and express the novel gene named elongation factor 1 (EF-1) of Taenia saginata asiatica in order to analyze the immunogenicity of the recombinant protein. Methods By screening the full length cDNA plasmid library， the coding region of EF-1 was amplified with PCR， and cloned into the prokaryotic expression vector pET-28a(+) and then expressed in E.coli BL21 with IPTG induction. The recombinant protein was detected by SDS-PAGE and purified by Ni-IDA affinity chromatography， and its immunogenicity was analyzed by Western blotting. Results PCR， double enzyme digestion and DNA sequencing confirmed that the recombinant expression plasmid was successfully constructed. Western blot analysis of EF-1 recombinant protein testified that the recombinant protein could be recognized by immunizing the serum of swine and patient， therefore indicating its immunogenicity. Conclusion A novel gene coding EF-1 of Taenia saginata asiatica was cloned and expressed successfully. The purified protein of EF-1 will be of importance for further research on the biological function of the gene.
KEY WORDS: Taenia saginata asiatica; elongation factor 1(EF-1); molecular cloning; prokaryotic expression
亞洲牛帶絳蟲(Taenia saginata asiatica)是近30年來發(fā)現(xiàn)的一種成蟲形態(tài)與牛帶絳蟲相似，而囊尾蚴卻與豬囊尾蚴相似并以豬作為中間宿主的人體帶絳蟲。2006年我們在前期研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步系統(tǒng)地開展對亞洲牛帶絳蟲在分類地位、分子診斷和疫苗等方面的研究［1-4］，為制定預(yù)防人體帶絳蟲病策略提供依據(jù)。本研究從亞洲牛帶絳蟲成蟲cDNA質(zhì)粒文庫中篩選出一個延伸因子-1(elongation factor 1， EF-1)的同源基因，構(gòu)建了pET-28a(+)-EF-1原核表達(dá)載體，并對其原核表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行了初步的免疫學(xué)研究，為進(jìn)一步研究其生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 血清來源
感染亞洲牛帶絳蟲豬血清由貴陽醫(yī)學(xué)院寄生蟲學(xué)教研室提供，患者血清采自亞洲牛帶絳蟲流行區(qū)貴州省都勻市米秀鄉(xiāng)，健康人血清由中山大學(xué)熱帶病重點實驗室提供。
1.1.2 文庫、質(zhì)粒、菌株
蟲體標(biāo)本采自亞洲牛帶絳蟲流行區(qū)貴州省都勻市米秀鄉(xiāng)，亞洲牛帶絳蟲成蟲全長cDNA質(zhì)粒文庫的構(gòu)建、EST測序及Unigene 分析與上海聯(lián)合基因有限公司合作完成。原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)和大腸桿菌BL-21/DE3由中山醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)實驗室保存。
1.1.3 主要試劑和工具酶
Ex Taq酶(含dNTP)、EcoRⅠ、XhoⅠ、T4 DNA連接酶及DNA標(biāo)準(zhǔn)(DL2000)均購自大連寶生物工程公司；異丙硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)購自美國Promega公司；Ni-IDA Agarose(cat No：69670)購自美國Novagen公司；蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)購自立陶宛MBI公司；DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒純化試劑盒購自北京賽百盛基因公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗豬IgG二抗、DAB(3，3二氨基聯(lián)苯胺)顯色試劑盒均購自武漢博士德有限公司；PVDF膜購自Millipore公司；TMB顯色試劑盒購自美國BD公司；SDS、丙烯酰胺、亞甲叉雙丙烯酰胺、過硫酸胺、尿素等試劑均購自上海申友生物科技公司。
1.1.4 引物合成和DNA測序
基因擴(kuò)增引物和重組質(zhì)粒DNA測序由Invitrogen上海生物技術(shù)有限公司合成。
1.2 方法
1.2.1 EF-1基因的識別
將獲得的亞洲牛帶絳蟲unigene進(jìn)行Blastx分析，獲得編碼亞洲帶絳蟲成蟲延伸因子-1基因文庫質(zhì)粒編號為T.a HC23-E9，GenBank登錄號為EF420501的同源基因；并通過瑞士生物信息學(xué)研究所的蛋白分析專家系統(tǒng)(ExPASY， ca.expasy.org/)預(yù)測其理化特性。
1.2.2 EF-1基因的擴(kuò)增 根據(jù)已獲得的EF-1編碼序列，利用DNAClub和PCRdesign設(shè)計引物。上游引物：CTAGAATTCATGGAGTGTGCGTTGAAGTTC，帶EcoRⅠ酶切位點；下游引物：GGGCTCGAGTTACAATTTGTTGAAGGAAG，帶XhoⅠ酶切位點。以亞洲牛帶絳蟲成蟲cDNA文庫中EF-1基因的克隆質(zhì)粒為模板，94 ℃預(yù)變性5 min后，熱循環(huán)參數(shù)為94 ℃ 1 min，57 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共35個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物10 g/L瓊脂糖凝膠電泳回收。
1.2.3 重組原核表達(dá)質(zhì)粒［pET-28a(+)-EF-1］的構(gòu)建及鑒定
將PCR產(chǎn)物和原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)經(jīng)EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切后回收，連接、轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL-21/DE3感受態(tài)細(xì)胞，卡那霉素篩選陽性克隆。對陽性克隆提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR、雙酶切和測序鑒定。
1.2.4 重組蛋白的表達(dá)
將確定能表達(dá)重組蛋白的單菌落接種于5 mL LB培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)后1∶100轉(zhuǎn)接到1 000 mL培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至A600約為0.6時加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，28 ℃、250 r/min進(jìn)行誘導(dǎo)。誘導(dǎo)4 h后離心收菌，用SDS-PAGE檢測蛋白質(zhì)的表達(dá)。
1.2.5 菌體的裂解、重組蛋白可溶性判斷及待純化融合蛋白上清的制備
取單菌落接種于1 000 mL含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃震蕩培養(yǎng)至A600為0.6時，加入IPTG使其終濃度為1 mmol/L，28 ℃震蕩培養(yǎng)4 h，4 ℃離心(6 000 g×10 min)，收集菌液，按文獻(xiàn)［5］的方法，每克菌(濕重)加入3 mL裂解緩沖液，重懸細(xì)菌沉淀，裂解液冰上超聲破碎(160 W，超聲1 s，停2 s，超聲5 min)，4 ℃ 13 000r/min離心20 min，收集上清和沉淀，分別取上清10 μL加入4×SDS上樣緩沖液和沉淀微量加1×SDS上樣緩沖液，煮沸5-10 min后行150 g/L SDS-PAGE判斷重組蛋白的可溶性。
1.2.6 尿素變性純化重組蛋白
在得到的包涵體(超聲后沉淀)中加入A液10 mL重懸，4 ℃ 12 000 r/min離心15 min，棄上清，重復(fù)2次，再用B液洗滌1次，4 ℃ 6 000 r/min離心15 min。將洗滌后的包涵體沉淀加入8 mol/L尿素(溶于基礎(chǔ)液)18 mL放置1 h左右，沉淀完全溶解，溶液清亮透明。采用透析法，逐步降低尿素濃度(8-6-5-4-3-2-1 mol/L PBS溶液)。
1.2.7 Western blotting檢測重組蛋白的免疫反應(yīng)性
將純化的蛋白進(jìn)行120 g/L SDS-PAGE電泳，使用電轉(zhuǎn)移儀于100 V冰浴轉(zhuǎn)印1.5 h，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，將含預(yù)染蛋白Marker條帶剪下，PVDF膜轉(zhuǎn)入感染亞洲牛帶絳蟲豬和患者血清中(1∶100稀釋)，室溫孵育2 h，PBS洗滌3次，每次5 min。然后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗豬和抗人IgG(1∶2 000稀釋)，室溫孵育1 h，PBS洗滌3次，每次5 min，DAB顯色至出現(xiàn)目的條帶，超純水終止反應(yīng)［6］。
2 結(jié) 果
2.1 生物信息學(xué)分析
該基因與細(xì)粒棘球絳蟲EF-1基因(登錄號為AAF641192.1)的氨基酸序列的一致性達(dá)87%，相似性達(dá)91%；全長988 bp，編碼區(qū)67-868，編碼269個氨基酸。理論分子質(zhì)量和等電點分別是28 067.8 u和4.88［7］。
2.2 原核重組質(zhì)粒的鑒定
將重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR和雙酶切鑒定，產(chǎn)物進(jìn)行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果顯示在500-1 000 bp之間有一清晰的條帶，與目的基因的大小基本相符，證明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功(圖1)。
2.3 蛋白表達(dá)純化結(jié)果
將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.Coli BL-21/DE3中表達(dá)，SDS-PAGE電泳分析結(jié)果如圖2中第4、5泳道所示，大約在34 ku左右處出現(xiàn)表達(dá)條帶，與目的蛋白分子量基本相符。通過破包涵體，將蛋白進(jìn)行純化，結(jié)果如圖2中第6、7泳道所示，其位置與目的蛋白相符，證明目的蛋白純化成功。
2.4 Western blotting鑒定
感染亞洲牛帶絳蟲的豬血清以及感染亞洲牛帶絳蟲的患者血清對純化蛋白的Western blotting均顯示出清晰的條帶(圖3)。
3 討論
研究表明，EF-1是一種在細(xì)胞內(nèi)普遍存在且大量表達(dá)的多聚體核糖體蛋白質(zhì)，在基因表達(dá)、翻譯過程中起重要作用［8］。EF-1可能由α、β、γ、δ四個亞基組成，其中EF-1α屬于G蛋白家族，它和氨酰tRNA、GTP一起組成復(fù)合體，通過正確地識別mRNA上的密碼子和tRNA上的反密碼子，負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)氨酰tRNA 到80S核糖體，并具有低水平GTP酶的活性。EF-1β具有鳥苷酸交換活性，在EF-1α從核糖體離開并且構(gòu)象由GDP形式變成GTP準(zhǔn)備與新的AA-tRNA相互作用的過程中，需要EF-1β作為催化劑。EF-1γ常與EF-1β形成復(fù)合物，具有增加后者鳥苷酸交換的功能。至少在脊椎動物中，EF-1還有第四個亞基EF-1δ，尤其在其羧基端與EF-1β具有同源性，而在氨基端無同源性，表明它們可能具有不同的功能［9-10］。我們從亞洲牛帶絳蟲cDNA文庫中識別出了一個EF-1的全長編碼基因，其編碼的氨基酸序列與GenBank中細(xì)粒棘球絳蟲的EF-1基因 (登錄號為AAF64192.1)的氨基酸序列的一致性達(dá)87%，相似性達(dá)91%，推測其為亞洲牛帶絳蟲EF-1基因，并且含有完整的開放閱讀框，是一個全長cDNA序列。
通過生物信息學(xué)分析，該蛋白的理論分子質(zhì)量為28 067.8 u，而質(zhì)粒pET-28a(+)的載體標(biāo)簽序列的分子質(zhì)量為6 ku，所以重組蛋白的分子質(zhì)量大約應(yīng)為34 ku。圖2的4泳道顯示的重組蛋白條帶與預(yù)期的大小是一致的，并且條帶很濃，但從該圖的5泳道看出上清沒有表達(dá)，說明該蛋白是以包涵體的形式表達(dá)，通過尿素變性純化重組蛋白，得到了條帶很濃的純化蛋白(圖2第7泳道)。本研究為包涵體蛋白的純化積累了經(jīng)驗，同時還證實了重組蛋白在純化后具有免疫反應(yīng)性，獲得了具有免疫活性的重組蛋白，為進(jìn)一步研究其生物學(xué)功能以及在診斷尤其是疫苗研究方面的作用奠定了基礎(chǔ)。
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