發(fā)布時(shí)間：2024-01-02 10:36:44
序言：寫(xiě)作是分享個(gè)人見(jiàn)解和探索未知領(lǐng)域的橋梁，我們?yōu)槟x了8篇的細(xì)胞生物學(xué)研究樣本，期待這些樣本能夠?yàn)槟峁┴S富的參考和啟發(fā)，請(qǐng)盡情閱讀。
關(guān)鍵詞： 細(xì)胞生物學(xué) 考試方法 改革策略
細(xì)胞生物學(xué)作為生物學(xué)相關(guān)專業(yè)的基礎(chǔ)課程，其考核環(huán)節(jié)一直為我國(guó)高校相關(guān)專業(yè)所重視。傳統(tǒng)細(xì)胞生物學(xué)課程的考試環(huán)節(jié)主要以閉卷檢測(cè)作為考核方式，以考試分?jǐn)?shù)作為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)學(xué)生的學(xué)習(xí)能力及學(xué)習(xí)成績(jī)進(jìn)行評(píng)定。這種考核方法難以有效地反映學(xué)生的綜合素質(zhì)，因此對(duì)細(xì)胞生物學(xué)課程考試方法進(jìn)行改革具有一定的必要性。
一、細(xì)胞生物學(xué)課程考試改革的原則與思路
（一）考試方法改革原則
由于細(xì)胞生物學(xué)課程專業(yè)性及理論性較強(qiáng)，對(duì)該課程考試的改革應(yīng)以培養(yǎng)學(xué)生的自主創(chuàng)新能力及動(dòng)手實(shí)踐能力作為切入點(diǎn)，根據(jù)學(xué)生的實(shí)際專業(yè)需求及個(gè)人能力的差異性對(duì)學(xué)生能力進(jìn)行評(píng)價(jià)[1]。對(duì)專業(yè)成績(jī)的評(píng)述不應(yīng)單純地以閉卷理論試卷成績(jī)?yōu)樽罱K成績(jī)，應(yīng)當(dāng)綜合評(píng)價(jià)學(xué)生日常課堂表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)課表現(xiàn)及課堂討論等環(huán)節(jié)表現(xiàn)出的能力，并對(duì)成績(jī)比例進(jìn)行合理分配，具體考試方案由各專業(yè)教研部門(mén)自行確定。通過(guò)引入綜述論文、課堂發(fā)言、實(shí)驗(yàn)課表現(xiàn)等環(huán)節(jié)的成績(jī)?cè)u(píng)定，可以有效提高學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣。
（二）考試方法改革思路
對(duì)細(xì)胞生物學(xué)課程考試方法的改革，主要將考試成績(jī)合理地劃分為“閉卷理論考試（60%）+論文綜述（10%）+實(shí)驗(yàn)課表現(xiàn)（20%）+日常課堂表現(xiàn)（10%）”四個(gè)部分。
1.對(duì)學(xué)生日常課堂表現(xiàn)進(jìn)行評(píng)價(jià)
學(xué)生的學(xué)習(xí)活動(dòng)以課堂學(xué)習(xí)為主，因此對(duì)學(xué)生日常課堂表現(xiàn)進(jìn)行客觀評(píng)價(jià)可以有效地反映學(xué)生細(xì)胞生物學(xué)課程的知識(shí)水平及能力基礎(chǔ)。因此，將細(xì)胞生物學(xué)課程考試成績(jī)中的10%作為日常課堂表現(xiàn)的分值，主要對(duì)學(xué)生課堂參與程度、討論問(wèn)題積極性、師生互動(dòng)與溝通、課堂出勤率等方面進(jìn)行考察，從而有效地提高細(xì)胞生物學(xué)課程教學(xué)質(zhì)量。
2.對(duì)學(xué)生實(shí)驗(yàn)課表現(xiàn)進(jìn)行考核
細(xì)胞生物學(xué)課程主要由理論課及實(shí)踐課構(gòu)成，實(shí)踐課教學(xué)可以有效地對(duì)理論進(jìn)行驗(yàn)證，是學(xué)生深化理論、接觸生物學(xué)領(lǐng)域的重要途徑。傳統(tǒng)細(xì)胞生物學(xué)課程的考試主要側(cè)重期末閉卷考試的考試成績(jī)，對(duì)實(shí)驗(yàn)課考核重視程度不足，導(dǎo)致絕大多數(shù)生物教師在教學(xué)過(guò)程中缺乏相應(yīng)的重視。將細(xì)胞生物學(xué)課程考試成績(jī)中的20%作為實(shí)驗(yàn)課表現(xiàn)的分值，可以有效地提升學(xué)生實(shí)驗(yàn)操作的積極性。
3.設(shè)計(jì)論文綜述環(huán)節(jié)進(jìn)行考評(píng)
為了提升細(xì)胞生物學(xué)課程的考評(píng)的合理性，可以設(shè)計(jì)相應(yīng)的論文綜述環(huán)節(jié)，對(duì)學(xué)生整體知識(shí)結(jié)構(gòu)的掌握能力進(jìn)行考核。論文綜述環(huán)節(jié)可以在考試周前一周至兩周進(jìn)行，由教師提前布置相應(yīng)的論文論述主題，給予學(xué)生充足的時(shí)間撰寫(xiě)論文、制作幻燈片，在考核過(guò)程中由學(xué)生自主上臺(tái)進(jìn)行論文匯報(bào)，再由其他學(xué)生進(jìn)行自主提問(wèn)。在評(píng)分過(guò)程中，可以將細(xì)胞生物學(xué)課程考試成績(jī)中的10%作為論文綜述環(huán)節(jié)的分值。
二、細(xì)胞生物學(xué)課程考試改革應(yīng)注意的問(wèn)題
（一）加強(qiáng)相關(guān)教師的素質(zhì)培訓(xùn)
隨著新課程改革的深化，雖然學(xué)生成為課堂教學(xué)活動(dòng)的主體，但教師仍然處于主導(dǎo)者地位，教師的職業(yè)素質(zhì)及教學(xué)觀念直接影響細(xì)胞生物學(xué)課程考試方法改革的貫徹效果。因此，為了保證細(xì)胞生物學(xué)課程考試改革的有效性，我國(guó)高校相關(guān)專業(yè)應(yīng)當(dāng)開(kāi)展周期性培訓(xùn)，培養(yǎng)生物教師相應(yīng)的職業(yè)素養(yǎng)，相關(guān)專業(yè)教研室應(yīng)根據(jù)教學(xué)活動(dòng)的推進(jìn)對(duì)教師進(jìn)行跟蹤性的培訓(xùn)，積極開(kāi)展教學(xué)前期培訓(xùn)、教學(xué)中期檢測(cè)及教學(xué)末期總結(jié)，保證生物教師可以明確細(xì)胞生物學(xué)考試方法改革的必要性，并從考試改革入手提高課堂教學(xué)質(zhì)量。
（二）貫徹落實(shí)相應(yīng)的考核操作
在明確了細(xì)胞生物學(xué)課程考試方法改革的原則與思路之后，應(yīng)當(dāng)將相應(yīng)的方案與思路落實(shí)到實(shí)踐中，用實(shí)踐檢驗(yàn)理想化的方案，提高細(xì)胞生物學(xué)課程考試方法改革的合理性[2]。在實(shí)際考核操作過(guò)程中，教師應(yīng)當(dāng)制定相應(yīng)的規(guī)章制度明確相應(yīng)的考核流程，并對(duì)學(xué)生課堂表現(xiàn)、課堂出勤情況等評(píng)價(jià)因素進(jìn)行了解。在實(shí)際考核過(guò)程中，可以打破傳統(tǒng)單一性由教師評(píng)價(jià)學(xué)生的教學(xué)模式，引入相應(yīng)的學(xué)生互評(píng)、學(xué)生自評(píng)評(píng)價(jià)機(jī)制，尊重學(xué)生實(shí)際能力的差異性，對(duì)學(xué)生成績(jī)進(jìn)行合理的評(píng)估。
（三）在考核過(guò)程中加強(qiáng)教師的協(xié)作
由于細(xì)胞生物學(xué)課程考核具有較強(qiáng)的專業(yè)性及理論性，且考試改革涵蓋面與考察面較為廣泛，學(xué)生成績(jī)考核工作難以由一個(gè)教師單獨(dú)完成，因此應(yīng)當(dāng)以過(guò)程性目光看待細(xì)胞生物學(xué)課程考核工作，加強(qiáng)各環(huán)節(jié)教師的協(xié)作與溝通。在學(xué)生成績(jī)?cè)u(píng)價(jià)過(guò)程中，由不同的教師負(fù)責(zé)學(xué)生日常表現(xiàn)統(tǒng)計(jì)、學(xué)生論文綜述情況、學(xué)生試卷批閱等環(huán)節(jié)。在過(guò)程性評(píng)價(jià)中教師之間進(jìn)行合理化分工，可以有效提升學(xué)生成績(jī)考核的合理性。
（四）引導(dǎo)學(xué)生注重日常學(xué)習(xí)過(guò)程
細(xì)胞生物學(xué)課程考核不僅具有檢測(cè)教學(xué)成果的功能，還具備評(píng)價(jià)功及引導(dǎo)功能[3]。傳統(tǒng)側(cè)重期末考試成績(jī)的考核模式對(duì)教學(xué)成果的評(píng)價(jià)較單一，很容易導(dǎo)致學(xué)生陷入學(xué)習(xí)時(shí)僅注重考點(diǎn)的學(xué)習(xí)誤區(qū)。對(duì)細(xì)胞生物學(xué)課程考試方法的改革對(duì)學(xué)生日常表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)課表現(xiàn)等方面進(jìn)行綜合考核，因此教師應(yīng)當(dāng)注重引導(dǎo)學(xué)生的日常學(xué)習(xí)課程，盡可能地消除功利性的學(xué)習(xí)目的。
總而言之，細(xì)胞生物學(xué)不僅是一門(mén)集理論性、創(chuàng)造性為一體的學(xué)科，而且是臨床醫(yī)學(xué)及生物學(xué)的學(xué)科基礎(chǔ)。在教學(xué)考核過(guò)程中，相關(guān)教師應(yīng)當(dāng)明確考試的評(píng)價(jià)功能及引導(dǎo)功能，樹(shù)立素質(zhì)教育理念，利用多種形式的綜合性考核內(nèi)容對(duì)學(xué)生學(xué)習(xí)情況進(jìn)行考評(píng)。
參考文獻(xiàn)：
[1]竇曉兵，高佳，范春雷，胡林峰，錢穎，沃興德.細(xì)胞生物學(xué)課程考試方法改革的研究與實(shí)踐[J].經(jīng)營(yíng)管理者，2009，23：327.
[2]肖明珠，毛建文，李紅枝.醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)考試方法的改革與實(shí)踐[J].中國(guó)現(xiàn)代教育裝備，2010，15：172-173.
[3]楊麗，張君，謝菁，徐文靜，王巖.醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)考試方法改革的探討與實(shí)踐[J].教育教學(xué)論壇，2014，31：69-70.
[關(guān)鍵詞]RGD；人牙周膜細(xì)胞；黏附；增殖；堿性磷酸酶
[中圖分類號(hào)]Q813.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]1008-6455（2013）01-0054-03
The biological effects of arginlie-glycine-aspartic-Serine acid on periodontal ligament cell
BI Ying-chun，HE Yu-hong，XI Lan-lan
（Department of Stomatology，General Hospital of Jinan Military Area Command of Chinese，Jinan 250031，Shandong，China）
Abstract： Objective To observe the effects of arginlie-glycine-aspartic-Serine （RGDS） peptides on the biological behaviors of human periodontal ligament cells（PDL） so as to discuss the mechanism of RGDS and the feasibility of its applications in periodontal therapy. Methods The effects of RGDS on periodontal ligament cells adhesion，extension and as well as the effects on ALP were observed by cellular culture and solid bond phase analysis. Results RGDS could promote PDL adhesion and extension with significance at the concentration of 25～100mg/L（P
Key words：arginlie-glycine-aspartic；human periodontal ligament （PDL） cells； adhesion； proliferation； alkaline phosphatase
精氨酸 -甘氨酸-天門(mén)冬氨酸（Arg-Gly-Asp， RGD）三肽是多種細(xì)胞跨膜蛋白整合素的特異性配體，許多黏附蛋白所共有的細(xì)胞間及細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)識(shí)別的最小序列，這一序列在介導(dǎo)細(xì)胞黏附、遷徙和生長(zhǎng)方面起重要作用。牙周膜細(xì)胞在牙根面上的附著和增殖是牙周組織新附著的關(guān)鍵，本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖怯^察離體細(xì)胞培養(yǎng)條件下，外源性RGDS對(duì)牙周膜細(xì)胞的影響，為進(jìn)一步的臨床研究工作提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
1 材料和方法
1.1 材料：RGDS（Sigma）， 96孔培養(yǎng)板（Coster）， DMEM培養(yǎng)液和胰蛋白酶（Gibco），胎牛血清（FCS杭州四季青生物工程研究所）， 酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（DG3022A）， 牛血清白蛋白（BSA，博士德公司），噻唑鹽（MTT Sigma），ALP試劑盒，倒置顯微鏡（Olympus，Japan）。
1.2 人PDL的體外培養(yǎng)：取13～17歲因正畸需要拔除的新鮮前磨牙，隨即在無(wú)菌條件下用PBS緩沖液（含青、鏈霉素各1000U/ml）浸泡5～10min，并沖洗2次，除去血液，刮取牙根中1/3的牙周膜組織，剪成1mm3碎塊，均勻鋪于培養(yǎng)瓶底，瓶底向上，加入適量含100ml/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，在飽和濕度、50ml/LCO2、950ml/L空氣、37℃標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下孵育2h，翻轉(zhuǎn)，培養(yǎng)至長(zhǎng)出牙周膜細(xì)胞。用2.5g/L胰蛋白酶消化法進(jìn)行傳代，用免疫組化SABC法進(jìn)行角蛋白和波形絲蛋白染色，波形絲蛋白染色陽(yáng)性，角蛋白染色陰性，證明為中胚層組織來(lái)源。取第4代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。
1.3 PDL細(xì)胞黏附性的測(cè)試--固相結(jié)合分析[1]：將RGDS溶于PBS液，分別制成100mg/L，50mg/L， 25mg/L，12.5mg/L4種濃度，每濃度為一實(shí)驗(yàn)組。將各濃度組按每孔50μl包被96孔板，每種濃度4孔，陰性對(duì)照為10g/L BSA。將96孔板置于4℃，過(guò)夜。用PBS液洗96孔板各孔2次，加10g/L BSA，37℃封閉1h，PBS再洗2次。取第4代人PDL細(xì)胞，2.5g/L胰酶消化，離心，收集細(xì)胞，用不含血清的DMEM培養(yǎng)液吹懸細(xì)胞，形成5×108/L的細(xì)胞懸液，以每孔100μl接種于96孔板，37℃，50ml/LCO2條件下培養(yǎng)120min。取出培養(yǎng)板，PBS洗2次以去除未貼壁的細(xì)胞，2.5g/L胰酶消化，離心，將細(xì)胞懸浮于200μl無(wú)血清DMEM，血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)算細(xì)胞總量。
1.4 PDL細(xì)胞伸展性的測(cè)試：實(shí)驗(yàn)分組及96孔板的包被與實(shí)驗(yàn)方法1.3相同，用無(wú)血清DMEM調(diào)整細(xì)胞濃度至107/L，每孔接種100μl， 標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下孵育120min，倒置顯微鏡下觀察各孔并照相。計(jì)數(shù)伸展細(xì)胞（即至少有一個(gè)胞漿突起的細(xì)胞）數(shù)和未伸展細(xì)胞數(shù)，每組至少計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，計(jì)算伸展細(xì)胞的百分率。
1.5 RGDS對(duì)PDL細(xì)胞增殖的影響：實(shí)驗(yàn)分組及96孔板的包被與實(shí)驗(yàn)方法1.3相同，用無(wú)血清DMEM調(diào)整細(xì)胞濃度至107/L，每孔100μl接種于96孔板，10ml/LDMEM培養(yǎng)24h后，PBS 洗去未黏附細(xì)胞，重新加入10ml/L胎牛血清DMEM100μl，將96孔板置37℃、50ml/LCO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)5天后，MTT法測(cè)不同濃度RDGS對(duì)PDL細(xì)胞的影響。
1.6 RGDS對(duì)PDL細(xì)胞堿性磷酸酶（ALP）的影響：將PDL細(xì)胞按1.5的方法培養(yǎng)5天后， PBS洗3次，每孔加1ml/L TritonX-100 50μl，4℃過(guò)夜。次日每孔加堿性磷酸酶抗體100μl，37℃、50ml/LCO2孵育30min，加0.2mol/LNaOH 50μl終止反應(yīng)。酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀410nm檢測(cè)A值。
1.7 數(shù)據(jù)分析：運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS10.0進(jìn)行組間t檢驗(yàn)， P
2 結(jié)果
2.1 RGDS對(duì)PDL細(xì)胞黏附性和伸展性的影響：如表1所示，隨著RGDS濃度增加，其促進(jìn)PDL細(xì)胞的黏附率的作用逐漸增強(qiáng)，當(dāng)濃度為12.5mg/L時(shí)，與對(duì)照組相比較，既有促進(jìn)細(xì)胞黏附作用（P
細(xì)胞伸展性實(shí)驗(yàn)也說(shuō)明，在RGDS濃度為12.5mg/L時(shí)，即有促進(jìn)細(xì)胞伸展功能（P
2.2 RGDS對(duì)PDL細(xì)胞增殖和ALP的影響：RGDS在50～100mg/L可明顯促進(jìn)細(xì)胞增殖，濃度在25～100mg/L明顯提高HPDL細(xì)胞的ALP的活性。見(jiàn)表2。
3 討論
本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用固相結(jié)合分析技術(shù)，將RGDS固定于96孔板上，為排除血清中某些因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，在黏附和伸展實(shí)驗(yàn)中采用無(wú)血清的DMEM，在增殖和ALP活性檢測(cè)時(shí)，因培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)（5天），采用細(xì)胞能耐受的1%胎牛血清濃度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在濃度為25mg/L可顯著促進(jìn)PDL細(xì)胞的黏附、伸展，而較高濃度的促進(jìn)作用卻不明顯，可能在此濃度時(shí)細(xì)胞膜上受置已飽和，再增加RGDS并不能使黏附率明顯上升。而細(xì)胞伸展性也顯示，當(dāng)RGDS濃度達(dá)到25mg/L時(shí)，細(xì)胞在2h的伸展率達(dá)到了50%以上，倒置顯微鏡下可見(jiàn)經(jīng)RGDS處理過(guò)的細(xì)胞胞體呈梭行或多角性，既細(xì)胞有一個(gè)以上的突起，呈現(xiàn)良好的伸展?fàn)顟B(tài)。而未經(jīng)RGDS處理的對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)呈圓形，無(wú)突起或僅有少量突起，細(xì)胞伸展?fàn)顟B(tài)不佳。
精氨酸-甘氨酸-天門(mén)冬氨酸（RGD）是細(xì)胞外基質(zhì)中許多黏附蛋白所共同含有的一個(gè)三肽序列，它是黏附蛋白與細(xì)胞表面特異受體蛋白相互作用的識(shí)別位點(diǎn)。這些細(xì)胞表面膜蛋白被稱為整合素（integrin）。整合素家族的分子都是由α、β兩條鏈由非共價(jià)鍵連接組成的異源雙體，為一跨膜結(jié)構(gòu)，一端連接細(xì)胞內(nèi)的骨架系統(tǒng)，另一端通過(guò)RGD識(shí)別位點(diǎn)與細(xì)胞外基質(zhì)連接，形成配體-整合素-細(xì)胞骨架跨膜信息系統(tǒng)，從而將細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞骨架連接起來(lái)，引起細(xì)胞內(nèi)一系列生化改變：如：酪氨酸磷酸化、胞漿堿化、鈣離子濃度提高、大量磷脂代謝產(chǎn)物產(chǎn)生等，進(jìn)而影響多種組織細(xì)胞功能調(diào)控，包括胚胎發(fā)育、細(xì)胞的伸展、移動(dòng)、生長(zhǎng)、分化、血栓形成、創(chuàng)傷修復(fù)、腫瘤轉(zhuǎn)移等一系列重要生理病理過(guò)程[2-3]。1984年，Pierschbacher和Ruolslahti[4]首次用實(shí)驗(yàn)證實(shí)RGDS是纖維連接蛋白與其受體的特異性結(jié)合位點(diǎn)，可促進(jìn)鼠腎成纖維細(xì)胞在生物材料表面的黏附，從此對(duì)于RGD配體與受體相互作用機(jī)制的研究引起了人們的廣泛關(guān)注。許多學(xué)者[5]研究了RGD與生物材料的不同結(jié)合對(duì)細(xì)胞在粘附、增殖、遷徙等方面的影響，顯示RGD與材料表面的穩(wěn)定的連接是促進(jìn)細(xì)胞粘附、增殖的關(guān)鍵。
ALP是參與骨等硬組織形成﹑代謝﹑再生的重要調(diào)節(jié)物質(zhì)，它通過(guò)水解磷酸脂﹑ATP及焦磷酸鹽，能去除鈣化抑制物，提供能量，促進(jìn)鈣化[6]。同時(shí)ALP也是細(xì)胞分化活躍和具有成骨能力的標(biāo)志之一[7]。而牙周膜細(xì)胞具骨母樣細(xì)胞特性，ALP也是牙周膜細(xì)胞分化和向成骨樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化的先決條件。本實(shí)驗(yàn)中，RGDS在濃度25mg/L即可提高牙周膜細(xì)胞ALP水平，這可能是RGDS通過(guò)激活整合素受體蛋白，引起胞內(nèi)細(xì)胞骨架改變，從而促進(jìn)細(xì)胞貼壁、伸展，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖，使其分化提前，因此ALP水平的提高極可能是由于牙周膜細(xì)胞數(shù)量增加引起，但無(wú)論什么原因，RGDS這種促增殖與分化的作用在牙周組織修復(fù)過(guò)程中具有重要意義。
牙周組織再生的一個(gè)中心環(huán)節(jié)是牙槽骨和牙骨質(zhì)的重建及功能性牙周膜的完全再生，即形成牙周新附著，而PDL細(xì)胞作為具有異質(zhì)性的多能干細(xì)胞，其在根面上的黏附、生長(zhǎng)、分化是形成新附著的關(guān)鍵。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)RGDS可有效促進(jìn)PDL的黏附、伸展、增殖和分化。已有學(xué)者將含有RGD的七肽固定于I型膠原材料，PDL粘附率明顯提高[8]。因而如果將RGD應(yīng)用于引導(dǎo)牙周組織再生的過(guò)程中，則有可能促進(jìn)PDL細(xì)胞在根面上黏附、伸展，激活PDL細(xì)胞成骨功能，促進(jìn)牙周組織再生，這對(duì)體內(nèi)應(yīng)用RGDS促進(jìn)牙周新附著的形成有一定的指導(dǎo)意義。
[參考文獻(xiàn)]
[1]Horiuchi K，Amizuka N，Takeshita S，et al.Identification and characterization of a novel protein， periostin， with restricted expression to periosteum and periodontal ligament and increased expression by transforming growth factor beta[J].J Bone Miner Res，1999，14：1239-1249.
[2]Hynes RO.Integrins：versatility，modulation，and signaling in cell adhesion[J].Cell，1992 Apr 3，69（1）：11-25.
[3]Clark EA， Brugge JS. Integrins and signal transduction pathways： the road taken. [J].J Science，1995，268：233-238.
[4]Pierschbacher M D，Ruolslahti E. Cell attachment activity of fibronectin can be duplicated by small synthetic fragments of the molecule[J].Nature，1984，309：30-33.
[5]Hersel U，Dahmen C，Kessler H.RGD modified polymers：biomaterials for stimulated cell adhesion and beyond[J]. Biomaterials，2003，24（24）：4385-4415.
[6]Quarles LD，Yohay DA，Lever LW，et al.Distinct proliferative and bydifferentiated stages of murine MC3T3-E1 cell in culture：an in vitro model of osteoblast development[J]. J Bone Miner Res，1992，7（6）：683-687.
摘要從教學(xué)內(nèi)容、教學(xué)過(guò)程和考核方式等方面介紹了研究生細(xì)胞分子生物學(xué)課程的教學(xué)開(kāi)展與體會(huì)，為適應(yīng)多研究方向的研究生培養(yǎng)要求、提高教學(xué)效果提供參考。
關(guān)鍵詞研究生;細(xì)胞分子生物學(xué);教學(xué);內(nèi)容;考核
揚(yáng)州大學(xué)碩士研究生培養(yǎng)方案課程設(shè)置將細(xì)胞分子生物學(xué)作為生物學(xué)一級(jí)學(xué)科的學(xué)位課程，包含植物學(xué)、動(dòng)物學(xué)、生理學(xué)、水生生物學(xué)、微生物學(xué)、遺傳學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)與分子生物學(xué)、生物物理學(xué)、生態(tài)學(xué)等11個(gè)生物學(xué)二級(jí)學(xué)科。揚(yáng)州大學(xué)是江蘇省屬重點(diǎn)綜合性大學(xué)，目前設(shè)有27個(gè)學(xué)院，11個(gè)生物學(xué)二級(jí)學(xué)科分散在生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院、農(nóng)學(xué)院、獸醫(yī)學(xué)院、醫(yī)學(xué)院，各二級(jí)學(xué)科的研究方向也較廣泛，如何適應(yīng)這種多學(xué)院、多學(xué)科和多研究方向的碩士研究生培養(yǎng)要求，提高教學(xué)效果，揚(yáng)州大學(xué)不斷進(jìn)行嘗試、改革，構(gòu)建了適合各二級(jí)學(xué)科培養(yǎng)目標(biāo)要求的細(xì)胞分子生物學(xué)教學(xué)體系，現(xiàn)將這門(mén)課程的教學(xué)內(nèi)容、教學(xué)過(guò)程和考核方式介紹如下。
1細(xì)胞分子生物學(xué)的教學(xué)內(nèi)容
細(xì)胞分子生物學(xué)是隨著細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)發(fā)展而興起的一門(mén)較新的學(xué)科，是一門(mén)在分子水平上研究基因?qū)?xì)胞活動(dòng)調(diào)控以及各種細(xì)胞結(jié)構(gòu)的形成和功能執(zhí)行的科學(xué)[1]。對(duì)生物學(xué)專業(yè)的研究生來(lái)講，本科階段都學(xué)過(guò)細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)這2門(mén)課程，因此研究生所開(kāi)設(shè)的細(xì)胞分子生物學(xué)課程體系應(yīng)該和本科生的課程體系有所區(qū)別。由于傳統(tǒng)的細(xì)胞分子生物學(xué)教材與細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)在內(nèi)容上有很多雷同，若采用這些教材，很容易使研究生對(duì)該門(mén)課程失去興趣。揚(yáng)州大學(xué)將該門(mén)課程的教學(xué)內(nèi)容分為4個(gè)部分:細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞遺傳、細(xì)胞代謝與調(diào)控、細(xì)胞發(fā)育，該校沒(méi)有選擇任何固定教材，僅僅指定少數(shù)最新出版的教材作為參考書(shū)，如韓貽仁主編的分子細(xì)胞生物學(xué)[2]、Gerald Karp主編的Cell and Molecular Biology:Concepts and Experi-ments等[3]。
2細(xì)胞分子生物學(xué)的教學(xué)過(guò)程
揚(yáng)州大學(xué)細(xì)胞分子生物學(xué)的授課對(duì)象差異比較大，學(xué)生的來(lái)源和專業(yè)背景也不同，在教學(xué)過(guò)程中，筆者嘗試使用開(kāi)放式教師、開(kāi)放式教學(xué)和開(kāi)放式課堂的教學(xué)方法。
2.1開(kāi)放式教師
以往的研究生課程都是由固定的教師一上到底，由于教師的精力有限，不可能對(duì)細(xì)胞生物學(xué)各個(gè)領(lǐng)域的前沿知識(shí)都熟悉。為了解決這一問(wèn)題，揚(yáng)州大學(xué)采用不固定教師上課的制度，跨學(xué)科跨學(xué)院請(qǐng)資深教師進(jìn)行授課，確保學(xué)生能夠了解該領(lǐng)域的基本知識(shí)與前沿動(dòng)態(tài)。設(shè)置的4個(gè)部分教學(xué)內(nèi)容中，每一部分由1~2位專業(yè)教師負(fù)責(zé)主講，教師可結(jié)合自己的專業(yè)背景，根據(jù)不同教學(xué)模塊，設(shè)置具體的教學(xué)內(nèi)容，不拘泥于任何教科書(shū)進(jìn)行授課。有些教師的研究方向是植物，對(duì)植物細(xì)胞分子生物學(xué)的研究進(jìn)展和前沿動(dòng)態(tài)比較熟悉，講授植物細(xì)胞分子生物學(xué)可以做到深入淺出，而對(duì)動(dòng)物細(xì)胞分子生物學(xué)的講授效果會(huì)比較差，因此主講教師可選擇來(lái)自植物、動(dòng)物、微生物、病毒等研究方向的老師。對(duì)于學(xué)生，有些是來(lái)源于農(nóng)學(xué)院，其背景知識(shí)和興趣側(cè)重在植物方面，而有些來(lái)源于醫(yī)學(xué)院或獸醫(yī)學(xué)院，其背景知識(shí)和興趣側(cè)重在動(dòng)物方面，這就要求選擇具有不同學(xué)科背景的教師。開(kāi)展開(kāi)放式的教學(xué)方式，滿足不同學(xué)生的要求。
2.2開(kāi)放式教學(xué)
由于細(xì)胞生物學(xué)是生命科學(xué)的前沿學(xué)科之一，因此在把握現(xiàn)有教材和參考資料的基礎(chǔ)上，教學(xué)過(guò)程中要結(jié)合實(shí)際將細(xì)胞生物學(xué)相關(guān)領(lǐng)域的新進(jìn)展、新知識(shí)、新方法介紹給學(xué)生，拓寬學(xué)生知識(shí)的深度、廣度，培養(yǎng)其對(duì)未來(lái)工作的適應(yīng)能力。
在每一個(gè)教學(xué)模塊中，教師可通過(guò)不同的教學(xué)方式講解不同側(cè)重點(diǎn)的專題。如細(xì)胞結(jié)構(gòu)部分包括講了2個(gè)專題，一個(gè)是細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng):結(jié)構(gòu)、功能、蛋白質(zhì)分選和膜泡運(yùn)輸，另一個(gè)是細(xì)胞骨架與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)。內(nèi)膜系統(tǒng)一般是指內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、細(xì)胞核、溶酶體和液泡(包括內(nèi)體和分泌泡)5類細(xì)胞器膜的總稱，而廣義的內(nèi)膜系統(tǒng)概念也包括線粒體、葉綠體、過(guò)氧化物酶體、細(xì)胞核等細(xì)胞內(nèi)所有細(xì)胞器膜的總稱。在本科細(xì)胞生物學(xué)教學(xué)過(guò)程中，這些細(xì)胞器的形態(tài)結(jié)構(gòu)、功能和發(fā)生是分別獨(dú)立介紹。雖然這些細(xì)胞器具有各自獨(dú)立的結(jié)構(gòu)和功能[4]，但它們又是密切相關(guān)的，尤其是它們的膜結(jié)構(gòu)是可以相互轉(zhuǎn)換的，轉(zhuǎn)換的機(jī)制則是通過(guò)蛋白質(zhì)分選和膜泡運(yùn)輸來(lái)實(shí)現(xiàn)的。在講授內(nèi)膜系統(tǒng)時(shí)，可通過(guò)蛋白質(zhì)合成這條線將這些相關(guān)內(nèi)容串聯(lián)起來(lái)講述。由于核糖體在蛋白質(zhì)合成上與內(nèi)膜系統(tǒng)互為一體，因此將核糖體也加入進(jìn)來(lái)，同時(shí)向上講可以提及細(xì)胞核中核糖體大小亞基及mRNA的合成，向下還可講述細(xì)胞膜上的蛋白功能，從而用蛋白質(zhì)合成一條線將細(xì)胞的三大結(jié)構(gòu)即細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核聯(lián)系了起來(lái)。同時(shí)，也啟迪研究生自己去找線索，找出一根主干，將盡可能多的內(nèi)容串起來(lái)。又如細(xì)胞骨架對(duì)于維持細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)及內(nèi)部結(jié)構(gòu)的有序性以及在細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、物質(zhì)運(yùn)輸、能量轉(zhuǎn)換、信息傳遞和細(xì)胞分化分裂等一系列方面起重要作用，因此對(duì)細(xì)胞骨架的研究是近代生命科學(xué)中最活躍的研究領(lǐng)域之一，它的快速發(fā)展主要得益于大型分析儀器的應(yīng)用和實(shí)驗(yàn)方法技術(shù)的改進(jìn)。在這一部分內(nèi)容的教學(xué)中，可重點(diǎn)向?qū)W生講解細(xì)胞骨架的研究方法，包括每種方法的原理、基本過(guò)程和結(jié)果分析，以最新的國(guó)外權(quán)威期刊上發(fā)表的細(xì)胞骨架方面的論文為例，向?qū)W生介紹細(xì)胞骨架的研究是如何開(kāi)展的。
2.3開(kāi)放式課堂
研究生課堂和本科生課堂相比，講授內(nèi)容量非常大。筆者一般會(huì)在課后將課件提供給學(xué)生，使他們?cè)谡n堂上不用花太多精力記筆記，而是將主要精力集中到聽(tīng)課上，跟著教師的引導(dǎo)考慮問(wèn)題，這樣使其思維保持很高的興奮度，且感到疲勞。在嚴(yán)格遵守課堂紀(jì)律的前提下，在上課時(shí)要盡量調(diào)動(dòng)學(xué)生的積極性，以開(kāi)拓學(xué)生的思維，培養(yǎng)創(chuàng)造性。課后要讓學(xué)生自己閱讀指定或推薦的原始文獻(xiàn)，或者讓他們自己到網(wǎng)上查閱自己感興趣的問(wèn)題，以此可培養(yǎng)學(xué)生閱讀文獻(xiàn)、查找資料、進(jìn)行科研的能力。
3細(xì)胞分子生物學(xué)的考核方式
作為生物學(xué)一級(jí)學(xué)科碩士研究生的學(xué)位課程，細(xì)胞分子生物學(xué)的考核以考試為主，考慮到研究生學(xué)習(xí)細(xì)胞分子生物學(xué)課的目的主要是為了提高學(xué)生利用學(xué)到的細(xì)胞生物學(xué)知識(shí)解決課題研究中的問(wèn)題，實(shí)用性較強(qiáng)，因此筆者選用開(kāi)卷考試的形式，所出的試題都是綜合性的分析題，在考場(chǎng)內(nèi)學(xué)生可以查閱任何參考資料，但參考資料中沒(méi)有現(xiàn)成的答案，促使學(xué)生綜合運(yùn)用所學(xué)知識(shí)，通過(guò)仔細(xì)分析才能得出答案。這種考核方式一方面提高了學(xué)生獨(dú)立思考問(wèn)題和解決問(wèn)題的能力，另一方面也使教師了解了學(xué)生對(duì)這門(mén)課程的掌握情況，檢驗(yàn)教學(xué)質(zhì)量，很大程度上促進(jìn)了以后教學(xué)的開(kāi)展。
4參考文獻(xiàn)
[1] 王石平，金安江.分子細(xì)胞生物學(xué)研究性教學(xué)模式的改革實(shí)踐與思考[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào):社會(huì)科學(xué)版，2008(2):134-137.
[2] 韓貽仁.分子細(xì)胞生物學(xué)[M].2版.北京:科學(xué)出版社，2001.
與臨床病理學(xué)相比，腫瘤分子生物學(xué)標(biāo)記為腫瘤生物學(xué)行為的分析、治療方式的選擇、臨床預(yù)后的判斷提供了更客觀、更豐富的信息，全文就目前國(guó)內(nèi)外對(duì)膀胱移行細(xì)胞癌分子生物學(xué)標(biāo)記物的研究概況作一綜述。
【關(guān)鍵詞】 膀胱移行細(xì)胞癌 標(biāo)志物 分子生物學(xué) 免疫學(xué)
膀胱移行細(xì)胞癌（TCC）的主要特征有多中心性和易復(fù)發(fā)性，腫瘤細(xì)胞易于種植轉(zhuǎn)移，臨床上僅根據(jù)腫瘤病理判斷預(yù)后較為困難。鑒于此，目前對(duì)其分子生物學(xué)標(biāo)記物的研究愈來(lái)愈多，如p53、p21、Ki67、bcl?鄄2等。已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道分析了相關(guān)分子生物學(xué)標(biāo)記物與泌尿系統(tǒng)上皮腫瘤的病理分級(jí)、臨床分期、復(fù)發(fā)及生存率的關(guān)系，為診斷腫瘤、制定正確的治療方案及判斷預(yù)后等提供重要的信息，本文就目前已報(bào)道的分子生物學(xué)標(biāo)記物作一綜述。
1 癌基因與抑癌基因
1.1 p53
p53的突變或丟失在膀胱癌的檢出率為50％～60％，Migaldi等[1]分析不同年齡膀胱癌患者的p53表達(dá)，發(fā)現(xiàn)p53異常表達(dá)在小于45歲的膀胱癌患者更為常見(jiàn)。大量研究表明，p53的改變與膀胱癌的分期、分級(jí)、侵襲性有關(guān)，但其是否與膀胱癌的復(fù)發(fā)及生存率相關(guān)仍有爭(zhēng)議。Yeniyol等[2]采用免疫組化檢測(cè)48例膀胱移行細(xì)胞癌標(biāo)本中p53的表達(dá)，p53異常表達(dá)在不同臨床分期和病理分級(jí)間差異顯著，但未發(fā)現(xiàn)p53陽(yáng)性組與陰性組腫瘤復(fù)發(fā)率和死亡率有明顯差異。Stavropoulos（n＝58）和Ong（n＝64）等[3]也得出類似的結(jié)論。但另有多篇文獻(xiàn)報(bào)道，p53與膀胱癌的復(fù)發(fā)率和死亡率顯著相關(guān)。Sanchez等[4]報(bào)道復(fù)發(fā)的膀胱癌（n＝47）p53的異常表達(dá)明顯高于未復(fù)發(fā)者，p53的異常表達(dá)與膀胱癌的進(jìn)展和生存率相關(guān)。Wolf等報(bào)道p53異常表達(dá)與pT1G3膀胱癌（n＝30）的預(yù)后關(guān)系密切。
p53突變可能與膀胱原位癌（CIS）的生物學(xué)行為有關(guān)，導(dǎo)致CIS的侵襲性增加，Shariat等[5]檢測(cè)47例膀胱CIS的p53及其中39例標(biāo)本的p21表達(dá)，p53/p21聯(lián)合分析顯示出與腫瘤的復(fù)發(fā)、進(jìn)展及生存率之間密切的相關(guān)性，p53（+）/p21（+）患者腫瘤復(fù)發(fā)進(jìn)展和死亡的危險(xiǎn)程度遠(yuǎn)大于p53（+）/p21（-）或p53（－）/p21（－）者。
1.2 p21
關(guān)于p21與膀胱癌的報(bào)道結(jié)果并不統(tǒng)一，Chatterjee等[6]檢測(cè)p53、p21、pRb在164例TCC標(biāo)本中的表達(dá)，結(jié)果顯示p53、p21、pRb可作為判斷TCC復(fù)發(fā)率和5年生存率的獨(dú)立因子，三者聯(lián)合分析顯示出與TCC預(yù)后之間良好的相關(guān)性。Kuczyk MA等也認(rèn)為p21WAF/CIP1可以作為判斷膀胱癌生存率的獨(dú)立預(yù)后因子。Liukkonen等[7]檢測(cè)207例膀胱癌(pTa～pT1)標(biāo)本中p21WAF1/CIP1和細(xì)胞周期素D1的表達(dá)，平均隨訪4.9年，分析其與腫瘤分期、分級(jí)、細(xì)胞增殖率（MIB?鄄1指數(shù)）、p53、bcl?鄄2、生存率的關(guān)系。結(jié)果只有MIB?鄄1指數(shù)與無(wú)瘤生存率顯著相關(guān)（P=0.03），腫瘤復(fù)發(fā)率只與腫瘤分級(jí)（P=0.002）和細(xì)胞周期素D1的表達(dá)相關(guān)（P=0.04），提示p21WAF1/CIP1與其他因子相比預(yù)后作用較小，有關(guān)p21WAF1/CIP1在判斷膀胱癌預(yù)后中的意義有待進(jìn)一步闡明。
1.3 p16 /CDKN2A
Hitchings等[8]檢測(cè)78例TCC 標(biāo)本（pTa～pT1） p53、p16、pRb的表達(dá)，多因素分析顯示任何兩者的改變與腫瘤的進(jìn)展密切相關(guān)，p53和 p16同時(shí)表達(dá)異常者腫瘤的進(jìn)展可能性增加14.45 倍，提示p53和 p16可用來(lái)判斷pTa～pT1期膀胱腫瘤的進(jìn)展情況。Benedict等發(fā)現(xiàn)腫瘤標(biāo)本中p16/CDKN2A的表達(dá)與Rb的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，Rb強(qiáng)染色的標(biāo)本罕見(jiàn)p16陽(yáng)性染色，同時(shí)，伴染色體9p21的雜合丟失的腫瘤p16/CDKN2A失表達(dá)，Rb強(qiáng)表達(dá)。Primdahl等發(fā)現(xiàn)初診即為浸潤(rùn)型膀胱癌p16/CDKN2A的表達(dá)顯著低于繼發(fā)于Ta 或T1的浸潤(rùn)期腫瘤，有關(guān)進(jìn)一步解釋尚待研究。
1.4 Rb
Sanchez Zalabardo D等[4]隨訪47例浸潤(rùn)型膀胱癌患者，發(fā)現(xiàn)Rb表達(dá)異常的患者腫瘤進(jìn)展速度、復(fù)發(fā)率顯著升高。Sunanda等檢測(cè)164例TCC標(biāo)本pRb的表達(dá)，得出結(jié)論pRb可作為判斷TCC復(fù)發(fā)和生存率的獨(dú)立預(yù)后因子。另有報(bào)道對(duì)45例T1期膀胱腫瘤患者隨訪發(fā)現(xiàn)Rb基因的丟失與pRb的異常表達(dá)明顯導(dǎo)致患者無(wú)瘤生存率降低，此外，多篇文獻(xiàn)報(bào)道Rb在與p21、p16、Ki67、p53等聯(lián)合判斷膀胱癌預(yù)后時(shí)表現(xiàn)出良好的相關(guān)性，可作為較理想預(yù)后因子。
2 細(xì)胞增殖相關(guān)指標(biāo)
細(xì)胞核相關(guān)抗原（Ki67）是增殖性細(xì)胞核的標(biāo)記物，可通過(guò)單克隆抗體MIB?鄄1檢測(cè)，其在判斷膀胱癌預(yù)后中的重要意義被越來(lái)越多的作者證實(shí)。Migaldi等發(fā)現(xiàn)老年患者膀胱癌標(biāo)本MIB?鄄1指數(shù)高于年輕者，并且與膀胱癌復(fù)發(fā)率、生存率密切相關(guān)[9]。Nakopoulou等(n=94)、Saika等（n=203）、Santos等（n＝159）也研究發(fā)現(xiàn)Ki67是膀胱癌良好的獨(dú)立預(yù)后因子。
Frank等[10]選取伴區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的尿道膀胱腫瘤139例，手術(shù)切除腫瘤并行化療，隨訪分析p53和MIB?鄄1在判斷腫瘤預(yù)后及化療療效中的作用，結(jié)果并未發(fā)現(xiàn)p53和MIB?鄄1與該類腫瘤患者的預(yù)后具有顯著性相關(guān)，但MIB?鄄1指數(shù)與腫瘤的化療療效呈顯著負(fù)相關(guān)，提示MIB?鄄1可以作為判斷膀胱癌化療療效的指標(biāo)，指導(dǎo)臨床治療。同樣，Matsumoto等對(duì)62例膀胱移行細(xì)胞癌（pT1G3～pT4M0）標(biāo)本進(jìn)行類似研究，平均隨訪34個(gè)月，發(fā)現(xiàn)Ki67的表達(dá)與腫瘤化療完全緩解率顯著性相關(guān)，能較好地判斷療效。
3 細(xì)胞凋亡相關(guān)指標(biāo)
3.1 bcl?鄄2/bax
bcl?鄄2被認(rèn)為是抑制細(xì)胞凋亡的重要的原癌基因。bcl?鄄2、bax屬于凋亡調(diào)控基因bcl?鄄2 基因家族， 分別能夠阻遏和促進(jìn)凋亡， bax?鄄bax同源二聚體促進(jìn)凋亡，bcl?鄄2?鄄bax異聚體阻遏凋亡，突變的p53蛋白可起到與bcl?鄄2蛋白類似的作用，并抑制bax基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而抑制凋亡。
Uchida T等觀察到119例膀胱癌患者中p53的表達(dá)與腫瘤分期分級(jí)相關(guān)，bcl?鄄2表達(dá)與腫瘤臨床病理特征無(wú)關(guān)，但p53和bcl?鄄2同時(shí)過(guò)表達(dá)提示不良預(yù)后[11]。Wolf、Gazzaniga等也證實(shí)bcl?鄄2的表達(dá)與腫瘤復(fù)發(fā)率和無(wú)瘤生存率明顯相關(guān)。但 Asci R等[12]報(bào)道年齡小于40歲患者TCC細(xì)胞漿bcl?鄄2和p53的表達(dá)分別為54%、37%，與腫瘤的進(jìn)展無(wú)明顯相關(guān)。同樣，F(xiàn)raile、Stavropoulos等報(bào)道bcl?鄄2的表達(dá)與膀胱癌的分期、分級(jí)及復(fù)發(fā)率無(wú)明顯相關(guān)，提示有關(guān)bcl?鄄2的作用仍需進(jìn)一步研究。
3.2 Fas/FasL
Fas與FasL都是跨膜蛋白，分別屬于TNF受體和TNF家族，T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞的活化可導(dǎo)致細(xì)胞表面FasL被激活，與Fas結(jié)合，使表達(dá)Fas的細(xì)胞發(fā)生凋亡。Lee SH等檢測(cè)37例膀胱癌標(biāo)本，F(xiàn)as/FasL的高表達(dá)達(dá)到92％。Lee等報(bào)道43例膀胱腫瘤標(biāo)本28％有Fas基因的突變。目前對(duì)血液中可溶性Fas (sFas)和可溶性FasL (sFasL)研究較多，Mizutani等[13]報(bào)道sFas或sFasL的升高預(yù)示Ta期膀胱癌患者早期復(fù)發(fā)的可能，sFas或sFasL可作為判斷Ta期膀胱癌復(fù)況的預(yù)后因子。
4 血管形成因子
4.1 VEGF
與大多數(shù)實(shí)體瘤一樣，膀胱癌的形成也具有血管形成依賴性，與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF關(guān)系密切。Vasilios等[14]研究VEGF和低氧誘導(dǎo)因子(HIF?鄄1α)之間的關(guān)系及兩者在TCC中的預(yù)后意義，結(jié)果顯示HIF?鄄1α與腫瘤病理分級(jí)顯著相關(guān)，VEGF和微血管密度（MVD）與腫瘤分級(jí)和臨床分期顯著相關(guān)。HIF?鄄1α與VEGF和MVD顯著相關(guān)，提示VEGF和HIF?鄄1α的升高刺激血管生成，導(dǎo)致腫瘤預(yù)后不良。同樣，Santos（n＝66）也報(bào)道VEGF可作為判斷膀胱上皮腫瘤的預(yù)后因子。
4.2 血栓黏合素?鄄1
血栓黏合素?鄄1(TSP?鄄1) 是細(xì)胞外基質(zhì)中的一種糖蛋白，分子量為430kD。TSP?鄄1被認(rèn)為是惟一抑制腫瘤血管形成的物質(zhì)。Grossfeld等[15]分析了163例TCC標(biāo)本TSP?鄄1、p53的表達(dá)與TCC復(fù)發(fā)生存率之間的關(guān)系，TSP?鄄1表達(dá)與TCC復(fù)發(fā) （P=0.009）和生存率（P=0.023) 顯著相關(guān)，低表達(dá)TSP?鄄1患者腫瘤復(fù)發(fā)率增高，生存率降低。
5 生長(zhǎng)因子及受體
5.1 EGFR
EGFR在眾多上皮腫瘤中有較高的陽(yáng)性表達(dá)，Colquhoun等[16]綜述了近年來(lái)有關(guān)EGFR與膀胱癌的研究，得出結(jié)論EGFR的表達(dá)與膀胱癌的分期、分級(jí)、復(fù)發(fā)率、無(wú)瘤生存率明顯相關(guān)，EGFR過(guò)表達(dá)提示腫瘤預(yù)后不佳，使用抑制EGFR活性的物質(zhì)如ZD 1839等可望成為臨床治療膀胱癌等的新手段。
5.2 TGFα
TGFα在膀胱癌中的表達(dá)顯著高于正常膀胱組織，Ravery等報(bào)道43例膀胱癌中60％存在TGFα高表達(dá)，且與腫瘤死亡率顯著相關(guān)。Ravery等分析28例早期膀胱腫瘤TGFα?鄄mRNA的表達(dá)，隨訪兩年發(fā)現(xiàn)其與腫瘤復(fù)發(fā)顯著相關(guān)，對(duì)判斷早期膀胱腫瘤的預(yù)后有重要價(jià)值。Thogersen等則報(bào)道TGFα與EGFR的表達(dá)相關(guān)，但與患者生存率無(wú)明顯相關(guān)，其在判斷膀胱癌預(yù)后中的作用有待研究。
6 細(xì)胞外基質(zhì)與細(xì)胞黏附分子
6.1 MMPs
Hara等[17]分析51例表淺TCC中MMP?鄄2、MMP?鄄9、膜型MMP?鄄1 (MT1?鄄MMP)與腫瘤復(fù)發(fā)率間的關(guān)系，復(fù)發(fā)組MMP?鄄9的表達(dá)是未復(fù)發(fā)組的2.5倍，未發(fā)現(xiàn)MMP?鄄2、MT1?鄄MMP表達(dá)的差異，MMP?鄄9高表達(dá)組無(wú)瘤生存率顯著低于正常表達(dá)組。同樣，Ozdemir等檢測(cè)60例膀胱癌MMP?鄄1，MMP?鄄2，MMP?鄄9的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)只有MMP?鄄9的表達(dá)與腫瘤的分期分級(jí)相關(guān)。Papathoma等報(bào)道隨著尿路上皮腫瘤分級(jí)和浸潤(rùn)程度的升高，MMP?鄄9和MMP?鄄2表達(dá)顯著升高，但兩者與腫瘤的復(fù)發(fā)率無(wú)明顯相關(guān)，提示其在判斷膀胱癌轉(zhuǎn)移和預(yù)后中的意義仍有待研究。
6.2 E?鄄鈣黏蛋白
E?鄄鈣黏蛋白的表達(dá)與腫瘤分化、癌細(xì)胞侵襲能力及轉(zhuǎn)移可能相關(guān)。Shahrokh等檢測(cè)53例膀胱CIS標(biāo)本E?鄄鈣黏蛋白的表達(dá)，隨訪131個(gè)月，多因素分析表明E?鄄鈣黏蛋白是與CIS復(fù)發(fā)、進(jìn)展、無(wú)瘤生存率顯著相關(guān)的獨(dú)立因素，提示E?鄄鈣黏蛋白異常表達(dá)的腫瘤侵襲性高，需要早期徹底治療。Rao等分析細(xì)胞支架蛋白－肌動(dòng)蛋白（Gelsolin）和E?鄄鈣黏蛋白在判斷膀胱癌預(yù)后中的意義，結(jié)果示Gelsolin與膀胱癌進(jìn)展和復(fù)發(fā)密切相關(guān)，但未發(fā)現(xiàn)E?鄄鈣黏蛋白在判斷膀胱癌預(yù)后中的顯著意義，其在判斷膀胱癌預(yù)后中的意義還有待明確。
與臨床病理學(xué)相比，腫瘤分子生物學(xué)標(biāo)記為腫瘤生物學(xué)行為的分析、治療方式的選擇、臨床預(yù)后的判斷提供了更客觀、更豐富的信息，深入研究此類標(biāo)記十分必要。目前對(duì)泌尿系統(tǒng)上皮腫瘤分子生物學(xué)標(biāo)記物的研究雖已取得進(jìn)展，但除了對(duì)個(gè)別標(biāo)記物Rb、Ki67的意見(jiàn)較為統(tǒng)一外，對(duì)絕大多數(shù)標(biāo)記物在腫瘤中的表達(dá)分布及預(yù)后價(jià)值仍存在爭(zhēng)議，目前的文獻(xiàn)報(bào)道多存在樣本量小的問(wèn)題，缺少大規(guī)模研究的支持，再加上免疫組化法檢測(cè)蛋白受抗體選擇、陽(yáng)性結(jié)果判斷、手工操作等外在因素影響的問(wèn)題，導(dǎo)致研究結(jié)果之間缺乏可比性或?qū)ν愌芯繉?duì)象得出相反的結(jié)論，因此需要將實(shí)驗(yàn)方法標(biāo)準(zhǔn)化以提高研究的可靠性和可重復(fù)性。此外，由于腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移是涉及多種分子機(jī)制的極其復(fù)雜的過(guò)程，僅憑對(duì)單一預(yù)后指標(biāo)的評(píng)估不能全面準(zhǔn)確地反映腫瘤的惡性潛能，腫瘤免疫標(biāo)記物最終的臨床應(yīng)用可能是多個(gè)指標(biāo)的綜合評(píng)估。
參考文獻(xiàn)
[1] Migaldi M， Rossi G， Maiorana A， et al. Superficial papillary urothelial carcinomas in young and elderly patients: a comparative study[J]. BJU Int， 2004， 94(3): 311-316.
[2] Yeniyol CO， Suelozgen T， Vardar E， et al. The relation of mutant p53 accumulation in transitional cell carcinoma of bladder with pathological stage， grade， recurrence and survival[J]. Int Urol Nephrol， 2001， 33(3): 473-478.
[3] Ong TA， Peh SC， Goh KS， et al. P53 protein expression in transitional cell carcinoma of the bladder?鄄experience of the university of Malaya Medical Centre[J]. Asian J Surg， 2003， 26(1): 31-36.
[4] Sanchez Zalabardo D， Rosell Costa D， Fernandez Montero JM， et al. Prognostic value of p53， Ki67， and Rb protein in infiltrating bladder tumors[J]. Actas Urol Esp， 2002， 26(2): 98-103.
[5] Shariat SF， Kim J， Raptidis G， et al. Association of p53 and p21 expression with clinical outcome in patients with carcinoma in situ of the urinary bladder[J]. Urology， 2003， 61(6): 1140-1145.
[6] Chatterjee SJ， Datar R， Youssefzadeh D， et al. Combined effects of p53， p21， and pRb expression in the progression of bladder transitional cell carcinoma[J]. J Clin Oncol， 2004， 22(6):1007-1013.
[7] Liukkonen T， Lipponen P， Raitanen M， et al. Evaluation of p21WAF1/CIP1 and cyclin D1 expression in the progression of superficial bladder cancer[J]. Urol Res， 2000， 28(5): 285-292.
[8] Hitchings AW， Kumar M， Jordan S， et al. Prediction of progression in pTa and pT1 bladder carcinomas with p53， p16 and pRb[J]. Br J Cancer， 2004， 91(3): 552-557.
[9] Duggan B， Williamson K. Molecular markers for predicting recurrence， progression and outcomes of bladder cancer (do the poster boys need new posters?) [J]. Curr Opin Urol， 2004， 14(5): 277-286.
[10] Frank I， Cheville JC， Blute ML， et al. Prognostic value of p53 and MIB?鄄1 in transitional cell carcinoma of the urinary bladder with regional lymph node involvement[J]. Cancer， 2004， 101(8): 1803-1808.
[11] Uchida T， Minei S， Gao JP， et al. Clinical significance of p53， MDM2 and bcl?鄄2 expression in transitional cell carcinoma of the bladder[J]. Oncol Rep， 2002， 9(2): 253-259.
[12] Asci R， Yildiz L， Sarikaya S， et al. p53 and bcl?鄄2 overexpression as associated risk factors in patients 40 years old or less with transitional cell carcinoma of the bladder[J]. Urol Int， 2001， 67(1): 34-40.
[13] Mizutani Y， Yoshida O， Ukimura O， et al. Prognostic significance of a combination of soluble fas and soluble fas ligand in the serum of patients with Ta bladder cancer[J]. Cancer Biother Radiopharm， 2004， 17(5): 563-567.
[14] Theodoropoulos VE， Lazaris ACh， Sofras F， et al. Hypoxiainducible factor 1α expression correlates with angiogenesis and unfavorable prognosis in bladder cancer[J]. Eur Urol， 2004， 46(2):200-208.
[15] Kausch I， Bohle A. Molecular aspects of bladder cancer.Ⅲ. Prognostic markers of bladder cancer[J]. Eur Urol， 2002， 41(1): 15-29.
目的初步探討何首烏提取物聚酰胺柱層析流分對(duì)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響。方法MTT比色法檢測(cè)何首烏提取物聚酰胺柱層析流分對(duì)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的促進(jìn)作用；HE染色法觀察其流分對(duì)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響。結(jié)果經(jīng)聚酰胺柱層析洗脫的何首烏流分對(duì)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖具有不同的作用，其中D流分隨著濃度的增加，對(duì)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖具有促進(jìn)作用，顯微鏡下觀察到細(xì)胞的數(shù)量及分裂相增多，B和C流分對(duì)細(xì)胞的增殖影響不大，而A流分對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞具有抑制生長(zhǎng)作用，細(xì)胞的數(shù)量減少，核固縮。結(jié)論何首烏提取物聚酰胺柱層析流分中含有促人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的活性物質(zhì)。
【關(guān)鍵詞】 何首烏 聚酰胺柱色譜 人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞 MTT比色法 HE染色法
Abstract:ObjectiveTo investigate the proliferation effects on human umbilical vein vascular endothelial cells(HUVECs)of the fractions isolated from Polygonum multiflorm Thunb extracted with polyamide column chromatography. MethodsThe activity of promoting HUVECs growth of each fraction was observed by MTT colorimetric assay. The changes of HUVECs morphology were observed by HE stain. ResultsThe fractions eluted from polyamide column chromatography had different proliferation activities on HUVECs. With the increase of concentration，the fraction D could promote the growth and proliferation of HUVECs significantly. The cells showed morphological change significantly under microscope. Compared with the control，the cell quantity and mitosis of the fraction D were increased. However， there was little or no effects on the proliferation of HUVECs by fraction B and C. In contrast， fraction A had an inhibitory effect on the growth of HUVECs ， which caused the decrease in the cell number and karyopycnosis. ConclusionThere are some components of promotion growth of HUVECs in the fraction from polygonum multiflorm Thunb.
Key words: Polygonum multiflorm Thunb.； Polyamide column chromatography； Human umbilical vein vascular endothelial cell(HUVEC)； MTT colorimetric assay； HE stain
何首烏Polygonum multiflorm Thunb.系蓼科植物何首烏的干燥塊根，具有烏須發(fā)、悅顏色、補(bǔ)肝腎、抗衰老之良效［1］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明其醇提或水提液具有提高免疫力、抑制血小板聚集、舒張血管、抗氧化等作用，且這些作用與其中的活性成分二苯乙烯苷（2，3，5，4＇-tetrahydroxy-stilbene-2-O-β-D-glucoside）有關(guān)［1，2］。二苯乙烯苷又稱芪多酚，屬多羥基芪類化合物，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，其具有清除自由基［2］、降低膽固醇［3］、保護(hù)肝臟等［4］作用。本實(shí)驗(yàn)采用MTT法和HE染色法觀察何首烏提取物聚酰胺柱層析流分對(duì)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響，為何首烏的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和利用提供依據(jù)。
1 材料與儀器
1.1 材料
聚酰胺（60～80目）和聚酰胺薄膜（10 cm×10 cm）購(gòu)于浙江省臺(tái)州市路橋四甲生化塑料廠；何首烏飲片購(gòu)自廣西醫(yī)藥公司；人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞購(gòu)自武漢大學(xué)保藏中心。
1.2 儀器
RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海博通)；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)；紫外線檢出器(日本)；二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo Forma MODEL 3111)；Σ960酶標(biāo)儀；倒置相差熒光顯微鏡（Olympus CXZIFSZ）；生物顯微鏡（日本Olympus）。
1.3 試劑乙醇；丙酮；甲醇(成都市科龍化工)；冰乙酸(上海實(shí)意化學(xué)試劑有限公司)；無(wú)水乙醇(重慶川江化工)；氯仿(廣東省化學(xué)試劑工程技術(shù)研究開(kāi)發(fā)中心)，以上試劑級(jí)別均為分析純。RPMI1640培養(yǎng)基（GIBCO Invitrogen cooperation）；新生牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)。
自配試劑 ：2%三氯化鐵-2%鐵氰化鉀顯色劑；0.5%胰蛋白酶溶液；PBS；蘇木精染液；伊紅染液及1%稀鹽酸乙醇溶液。
2 方法
2.1 何首烏流分提取分離取2 kg何首烏粉用4倍量70%乙醇回流提取，濃縮后的總浸膏依次采用環(huán)己烷、醋酸乙酯、正丁醇分別進(jìn)行萃取。采用聚酰胺柱層析法，以蒸餾水-乙醇為洗脫劑對(duì)正丁醇層浸膏進(jìn)行分離，收集各流分；點(diǎn)樣，在365 nm處用紫外燈觀察，并以2%三氯化鐵-2%鐵氰化鉀顯色跟蹤檢測(cè)，合并相同流分，減壓濃縮。按洗脫順序分別得到A，B，C，D流分組。
2.2 活性研究
2.2.1 細(xì)胞的培養(yǎng)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)為10%熱滅活新生牛血清的培養(yǎng)液中，置二氧化碳培養(yǎng)箱，在37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)。
2.2.2 MTT法測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)增殖實(shí)驗(yàn)取指數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用0.5%胰蛋白酶消化，加入含小牛血清的培養(yǎng)液計(jì)數(shù)并稀釋至1×104個(gè)/ml。將稀釋的細(xì)胞懸液按100 μl/孔接種至96孔板，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h至細(xì)胞貼壁后，選擇A，B，C，D 4種流分，每組設(shè)5個(gè)濃度梯度加入至96孔板中，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)平行孔。同時(shí)設(shè)PBS空白對(duì)照組6孔，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，取出孔板，每孔加入20 μl 5 mg/ml的MTT，37℃、5%CO2條件下孵育4 h，棄盡孔內(nèi)液，每孔中加入200 μl的DMSO溶解MTT產(chǎn)物。振蕩30 s，用酶標(biāo)儀于490 nm處測(cè)定每個(gè)孔的吸光值A(chǔ)值。計(jì)算存活率：細(xì)胞存活率(%)=(用藥組平均A值/對(duì)照組平均A值)×100%
2.2.3 HE染色法觀察流分對(duì)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)的影響取貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞，用0.5%胰蛋白酶消化，加入含小牛血清的培養(yǎng)液計(jì)數(shù)并稀釋至1×104個(gè)/ml。 將稀釋的細(xì)胞懸液按2 ml/孔接種至6孔板，加入已高壓滅菌的蓋玻片，培養(yǎng)24 h后，加入不同濃度的流分，藥物組設(shè)定如下：A流分組、D流分組，每組設(shè)兩個(gè)濃度梯度，每個(gè)濃度設(shè)2個(gè)平行孔；同時(shí)設(shè)2孔空白對(duì)照組。培養(yǎng)24 h后，取出蓋玻片。用95％乙醇固定，蘇木精及伊紅染色，乙醇脫水，二甲苯透明，最后用中性樹(shù)膠封片，攝像。
3 結(jié)果
3.1 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果不同濃度的流分分別作用于人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞后，采用MTT法測(cè)定其對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。其中流分D對(duì)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用，出現(xiàn)明顯的量效關(guān)系，即濃度越高，存活率越高。流分A對(duì)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞具有一定的抑制生長(zhǎng)作用。流分B，C與對(duì)照組比較，基本無(wú)差異。結(jié)果見(jiàn)表1。
表1 何首烏提取物4種流分對(duì)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的作用(略)
3.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變經(jīng)HE染色后顯微鏡觀察，可見(jiàn)正常的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞呈梭形，細(xì)胞漿豐富，均勻，細(xì)胞核規(guī)則，呈紫藍(lán)色，核內(nèi)染色均一。A流分組對(duì)細(xì)胞具有抑制作用，光鏡下觀察到細(xì)胞的數(shù)量減少，部分細(xì)胞特別是高濃度組出現(xiàn)胞漿減少，核固縮現(xiàn)象。D流分組對(duì)細(xì)胞具有明顯的促進(jìn)生長(zhǎng)作用，尤其是高濃度組表現(xiàn)為細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，核分裂相增多，細(xì)胞數(shù)量增多。見(jiàn)圖1。
4 討論
聚酰胺是通過(guò)己內(nèi)酰胺聚合而成的尼龍-6（錦綸、卡普隆）及由己二酸與己二胺聚合而成的尼龍-66，是一種白色多孔非晶型粉末，其分子中含有豐富的酰胺基，可與多酚類化合物的羥基（或羧基）形成分子間氫鍵而將其吸附。分子中酚羥基數(shù)目越多，芳香化程度越高的化合物與酰胺基的結(jié)合力越強(qiáng)，從而實(shí)現(xiàn)與其它物質(zhì)的分離［5］。結(jié)合本文MTT法結(jié)果可以知道，較晚洗脫出來(lái)的流分D，對(duì)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞具有促進(jìn)增殖生長(zhǎng)作用，推測(cè)流分D中促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的物質(zhì)可能與含有酚羥基數(shù)目較多有關(guān)。但要確定酚羥基是否為促人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的藥效團(tuán)有待進(jìn)一步研究。
血管內(nèi)皮細(xì)胞在維持血管張力和血流調(diào)節(jié)方面發(fā)揮重要作用，內(nèi)皮細(xì)胞還可以阻止血小板和白細(xì)胞的激活，所以完整的內(nèi)皮系統(tǒng)在維持血管穩(wěn)定和防止血栓方面發(fā)揮重要作用。臨床實(shí)踐證實(shí)中藥何首烏提取物對(duì)生物體多種代謝活性具有積極的影響作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在何首烏醇提物的正丁醇萃取物中含有對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖產(chǎn)生促進(jìn)作用的活性物質(zhì)，可使細(xì)胞的分裂相增多，染色質(zhì)豐富，為進(jìn)一步從何首烏中分離純化具有保護(hù)和修復(fù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的活性物質(zhì)提供了依據(jù)。
【參考文獻(xiàn)】
［1］李玉芳，何玄華.何首烏現(xiàn)代研究進(jìn)展［J］.中成藥，1997，19(5):37.
［2］Ryu G，Ju JH，Park YJ，et al. The radical scavenging effects of stilbene glucosides from Polygonum multiflorum［J］.Arch Pharm Res，2002，25(5):636.
［3］Arichi H， Kimura Y， Okuda H，et al. Effects of stilbene components of the roots of Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc. on lipid metabolism［J］.Chem Pharm Bull (Tokyo). 1982 ，30(5):1766
【摘要】 為了了解凍存復(fù)蘇過(guò)程對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 (mesenchymal stem cell，MSC) 生物學(xué)特性和支持造血能力的影響，采用常規(guī)方法分離培養(yǎng)骨髓MSC，將傳代后的細(xì)胞用含10％二甲亞砜、40％胎牛血清的IMDM細(xì)胞凍存液保存在-196℃液氮中，觀察短期（4周）和中期（9-15月）復(fù)蘇后MSC的活性、免疫表型、多向分化能力和支持造血的能力，并同凍存前的MSC進(jìn)行比較。 結(jié)果表明：中短期凍存后的MSC的細(xì)胞活性分別為(90士3.75)％和(93士2.51)％；凍存后細(xì)胞的增殖能力、免疫表型、體外分化為脂肪和骨細(xì)胞的能力、支持集落（CFU-GM，CFU-E，CFU-GEMM）的生長(zhǎng)作用和凍存前MSC相似。結(jié)論：骨髓MSC在液氮中短期和中期保存后，細(xì)胞活性略有下降，但是并不影響MSC的增殖、分化和支持造血能力。
【關(guān)鍵詞】 支持造血
Biological Characteristics and Ability of Supporting Hematopoiesis of Bone Marrow Mesenchymal
Stem Cells Pre-and Post-Cryop-reservation
Abstract This study was aimed to observe the biological characteristics of cryopreserved bone marrow mesenchymal stem cell (MSC) and to examine their abilities to support in vitro hematopoiesis.Bone marrow MSC were cryopreserved in -196℃ liquid nitrogen for 4 weeks (short term) and 9-15 months (medium term) with IMDM containing 10% DMSO，40% fetal calf serum as cryoprotectant.The viability，proliferation，immunophenotype，in vitro differentiation and ability of supporting hematopoiesis of thawed MSC were investigated and compared with these of pre-cryopreserved MSC.The results showed that the cell viability were (93士2.51)％ and (90士3.75)％ for MSC cryopreserved as long as 4 weeks or 9-15 months respectively.However，there were no changes detected，as compared with pre-cryopreserved MSC in immunophenotype，abilities of proliferation and supporting colony forming of CFU-GM，CFU-E and CFU-GEMM.It is concluded that bone marrow-derived MSC can be stored in liquid nitrogen for short-term (4 weeks) or medium-term (9-15 months) without changes of abilities of proliferation，differentiation and hematopoiesis support.
Key words cryopreservation; mesenchymal stem cell； hematopoiesis support
間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell，MSC）具有多向分化和支持造血的能力，而且來(lái)源廣泛，容易在體外培養(yǎng)和擴(kuò)增，目前已經(jīng)應(yīng)用于臨床并顯示了良好的治療效果［1-4］。將培養(yǎng)后的MSC凍存，在患者需要MSC治療時(shí)給予輸注，具有很好的臨床應(yīng)用前景。但是，凍存是否會(huì)影響MSC的生物學(xué)特征，我們尚不清楚。因此，本研究將骨髓來(lái)源的MSC凍存于-196℃液氮中，觀察中期和短期凍存后MSC的增殖、分化和支持造血的能力并同凍存前的MSC進(jìn)行比較，為進(jìn)一步在臨床中的應(yīng)用提供詳盡的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
材料和方法
試劑
IMDM、DMEM、DF12、MCDB培養(yǎng)液、胎牛血清、馬血清和甲基纖維素均為Gibco公司產(chǎn)品。鼠抗人CD11b、CD29、CD31、CD34、CD44、CD45、CD105和HLA-DR抗體購(gòu)自PharMingen公司; rh-SCF、 GM-CSF、 EPO、 IL-3購(gòu)自Peprotech公司;胰酶、EDTA、全反式維甲酸、1-甲基-3-異丁基-黃嘌呤（IBMX）和二甲亞砜（DMSO）購(gòu)自Sigma公司。
MSC的分離和培養(yǎng)
骨髓來(lái)自8例健康志愿者（年齡18-34歲，平均29歲）。髂后上棘抽取骨髓，用淋巴細(xì)胞分離液（密度1.077）400×g 離心20分鐘，取白環(huán)以上細(xì)胞部分，計(jì)數(shù)后接種于含40% MCDB、2% FCS的DF12培養(yǎng)液中，置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24小時(shí)后換液，去除未貼壁細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到70%融合時(shí)，常規(guī)消化傳代。
MSC的凍存和復(fù)蘇
將1×106細(xì)胞加入含10％ DMSO和40% FCS的IMDM中，總體積1.8 ml。先置于-80℃冰箱中，第二天轉(zhuǎn)入-196℃中凍存。將中期9-15個(gè)月（平均13個(gè)月）和短期（4周）凍存的MSC置于37℃水浴中快速?gòu)?fù)溫，凍融后加入8 ml IMDM混勻后離心，然后再用IMDM洗滌1次，置于37℃、5％ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第2天，更換新鮮培養(yǎng)液。
細(xì)胞活性和增殖能力測(cè)定
應(yīng)用臺(tái)盼藍(lán)拒染回收率（TBR）試驗(yàn)檢測(cè)復(fù)蘇細(xì)胞的活性，TBR(%)＝凍存后活細(xì)胞計(jì)數(shù)/凍存前活細(xì)胞計(jì)數(shù)×臺(tái)盼藍(lán)拒染率×100％。將凍存前后的MSC接種在24孔板中（5×103細(xì)胞/孔），置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔1天取2孔細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算均值，繪制生長(zhǎng)曲線。
細(xì)胞免疫表型分析
用含20 g/L BSA的PBS將胰酶消化后的MSC制成1×106 cells/ml的細(xì)胞懸液。每個(gè)上機(jī)試管中加入500 μl細(xì)胞懸液，先加入鼠抗人CD11b、CD29、CD31、CD34、CD44、CD45、CD105和HLA-DR單克隆抗體，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照，于4℃孵育30分鐘，PBS洗3遍。再加入FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG，4℃孵育30分鐘，PBS洗4遍，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。使用cellquest軟件獲取并分析數(shù)據(jù)。
體外誘導(dǎo)多向分化檢測(cè)
成骨誘導(dǎo) 將5×104細(xì)胞接種于6孔板中，加入含10-7mol/L地塞米松、10 mol/L β磷酸甘油、0.05 mol/L維生素C和10% FCS的IMDM，3周后應(yīng)用von Kossa染色檢測(cè)鈣化小結(jié)。
脂肪誘導(dǎo) 將5×104細(xì)胞接種于6孔板中，加入含10-6 mol/L地塞米松、0.5 mol/L IBMX 、0.1 mol/L維生素C和10% FCS的IMDM，7天后油紅O染色檢測(cè)脂肪滴。
支持造血的能力測(cè)定
將凍存前后的骨髓MSC用10.0 Gy 60Co γ線照射，然后更換為長(zhǎng)期培養(yǎng)液（含12.5％ FCS、 12.5%馬血清、2 mmol/L谷氨酰胺、10-6 mol/L 氫化考的松的IMDM）。獲取健康人骨髓單個(gè)核細(xì)胞，預(yù)先培養(yǎng)4小時(shí)以去除貼壁細(xì)胞，將懸浮細(xì)胞按照1×106/ml接種在照射后的MSC中，在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，每周半量換液。4周后獲取全部細(xì)胞接種于甲基纖維素體系中測(cè)定其集落形成能力。培養(yǎng)體系為: IMDM中含30%馬血清、1% BSA，2 mmol/L谷氨酰胺、1×10-4/L β2巰基乙醇、1%甲基纖維素和重組細(xì)胞因子。細(xì)胞因子包括: rhSCF 50 ng/ml，IL-3 10 ng/ml，GM-CSF 50 ng/ml 和EPO 4 U/ml。集落形成實(shí)驗(yàn)在24孔培養(yǎng)板中進(jìn)行，于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)14天。每孔接種1×106個(gè)細(xì)胞。14天后在倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)集落，50個(gè)以上細(xì)胞為1個(gè)集落。
統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
采用SPSS 11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，組間比較應(yīng)用方差分析。
結(jié) 果
骨髓MSC的形態(tài)特征和生長(zhǎng)特點(diǎn)
于倒置顯微鏡下，凍存前骨髓MSC為成纖維樣，胞漿豐富，核染色質(zhì)細(xì)，核仁明顯，平行排列或旋渦樣生長(zhǎng)。根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，骨髓MSC的倍增時(shí)間約為42.03士2.41小時(shí)。細(xì)胞形態(tài)和倍增時(shí)間隨著細(xì)胞傳代并不發(fā)生改變。
凍存后MSC的活性率和增殖能力
骨髓MSC的活性率（TBR）隨著凍存時(shí)間的延長(zhǎng)略有下降。短期凍存MSC的TBR為93士2.51％；中期凍存MSC的TBR為90士3.75％。二者之間并沒(méi)有顯著性差異。凍存后MSC的增殖能力同凍存前相比較，沒(méi)有明顯差異。依據(jù)生長(zhǎng)曲線可以得出短期和中期凍存后骨髓MSC的倍增時(shí)間分別為39.54士3.53小時(shí)和41.64士1.68小時(shí)。
凍存前后MSC的免疫表型
通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)凍存前后骨髓MSC的免疫表型發(fā)現(xiàn)，凍存前后MSC均表達(dá)CD29、CD44、CD105，而CD11b、CD31、CD34、CD45和HLA-DR均為陰性(表1)。CD分子的表達(dá)量在凍存前后略有不同，但均不存在顯著性差異。Table 1.Flow-cytometric phenotype analysis of adult bone marrow derived MSC before and after cryopreservation（略）
多系分化的鑒定
成骨分化 2周后細(xì)胞聚集成集落，并有少量鈣鹽沉積，繼續(xù)培養(yǎng)1周，細(xì)胞呈現(xiàn)多層生長(zhǎng)的結(jié)節(jié)狀，并有大量鈣鹽沉積，而對(duì)照組細(xì)胞仍為單層生長(zhǎng)，無(wú)鈣鹽沉積。von Kossa 染色證實(shí)為鈣鹽沉積(圖A)，對(duì)照組無(wú)上述現(xiàn)象出現(xiàn)。
成脂肪分化 3-5天后發(fā)現(xiàn)少量細(xì)胞中有小脂肪滴出現(xiàn)，繼續(xù)誘導(dǎo)，1周后可以看見(jiàn)大部分細(xì)胞胞體變大，胞漿出現(xiàn)大量脂肪滴，油紅O染色證實(shí)為脂肪滴(圖B)，而對(duì)照組細(xì)胞胞漿中無(wú)脂肪滴出現(xiàn)，油紅O染色為陰性。
凍存后的MSC同樣具有成骨和成脂肪分化能力(圖C，D)。
支持造血作用
為了評(píng)估凍存是否影響MSC支持造血的能力，將骨髓單個(gè)核細(xì)胞接種于照射過(guò)的凍存前和復(fù)蘇的MSC中，在長(zhǎng)期骨髓培養(yǎng)液中培養(yǎng)4周后檢測(cè)CFU生成情況。如表2所示，凍存前后MSC均具有支持造血作用。CFU-GM，CFU-E和CFU-GEMM的產(chǎn)率在以凍存前、短期凍存和中期凍存后MSC為滋養(yǎng)層的骨髓長(zhǎng)期培養(yǎng)體系中并無(wú)顯著性差異。Table 2.Hematopoiesis supported by MSC in long term bone marrow culture（略）
討 論
MSC是造血微環(huán)境中主要組成部分，通過(guò)合成、分泌多種造血因子和黏附分子來(lái)調(diào)控造血干細(xì)胞的增殖、分化和自我更新。既往研究顯示，MSC可以合成并分泌多種造血細(xì)胞生長(zhǎng)因子，具有維持長(zhǎng)期培養(yǎng)起始細(xì)胞(LTC-IC)的能力，促進(jìn)造血干細(xì)胞的增殖和分化［5］。聯(lián)合MSC的移植方案還可以促進(jìn)HSC的植入和移植后的造血恢復(fù)［6］。但是，在體外培養(yǎng)擴(kuò)增中，MSC的增殖能力會(huì)逐漸下降并發(fā)生分化，支持造血的能力減弱。將擴(kuò)增后或者增殖旺盛的MSC進(jìn)行凍存，在需要的時(shí)候復(fù)蘇培養(yǎng)，可以有效地解放上述問(wèn)題并確保提供足夠的MSC應(yīng)用于臨床。
既往的大量研究顯示，造血干細(xì)胞可以在液氮中長(zhǎng)期凍存，復(fù)蘇后仍然具有良好的造血重建能力。但是，MSC經(jīng)過(guò)低溫凍存和復(fù)蘇，其增殖和分化能力、支持造血功能是否受影響，尚不明確。因此，我們觀察了骨髓MSC經(jīng)過(guò)短期（4周）和中期（9-15月）凍存后的生物學(xué)特性和支持造血能力。結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)中期和短期凍存后MSC的形態(tài)并未發(fā)生改變，仍為梭形，貼附在培養(yǎng)瓶底。凍存后MSC的活性略有下降，但凍存并不影響細(xì)胞的增殖能力，凍存前和中期、短期凍存后MSC的倍增時(shí)間在40小時(shí)左右，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析不具有顯著性差異。通過(guò)FACS檢測(cè)，凍存前后的MSC的免疫表型沒(méi)有明顯改變，表現(xiàn)為CD29、CD44和CD105為陽(yáng)性，而CD11b、CD34、CD31、CD45、和HLA-DR為陰性。多向分化能力是MSC的主要特征之一，我們將經(jīng)過(guò)中期和短期凍存后MSC誘導(dǎo)向脂肪和骨分化，結(jié)果顯示凍存后MSC仍然具有向脂肪和骨分化的能力，而且這種分化能力，并不隨著復(fù)蘇后細(xì)胞的傳代而發(fā)生變化。由此可見(jiàn)，中期和短期凍存并不影響MSC的生物學(xué)特性。
支持造血是骨髓MSC的重要功能之一，凍存后MSC支持造血能力是否發(fā)生變化將直接影響MSC的臨床應(yīng)用。Majumdar等［7］的研究顯示，骨髓MSC可以分泌多種造血生長(zhǎng)因子，具有支持造血作用，能促進(jìn)骨髓來(lái)源的CFU-GM，CFU-E，CFU-Meg和CFU-GEMM的增殖。但是凍存后MSC支持造血能力如何變化，既往并無(wú)報(bào)道。在本實(shí)驗(yàn)中，我們通過(guò)檢測(cè)體外長(zhǎng)期培養(yǎng)體系中集落形成情況來(lái)評(píng)估凍存后MSC對(duì)造血干細(xì)胞的支持作用。骨髓單個(gè)核細(xì)胞在以凍存前、短期凍存和中期凍存后MSC作為滋養(yǎng)層的骨髓長(zhǎng)期培養(yǎng)體系中培養(yǎng)，4周后的骨髓單個(gè)核細(xì)胞的CFU生成率在各體系之間沒(méi)有顯著性差別。這說(shuō)明經(jīng)過(guò)中期和短期凍存后MSC仍具有支持造血能力，同凍存前比較，支持造血能力沒(méi)有明顯變化。進(jìn)一步分析上述不同培養(yǎng)體系中CFU-GM、CFU-E和CFU-GEMM的生成情況，結(jié)果表明：凍存前后MSC均可以促進(jìn)CFU-GM、CFU-E和CFU-GEMM的增殖，而且MSC促進(jìn)定向祖細(xì)胞的增殖能力在凍存前后沒(méi)有明顯差別。這些結(jié)果表明，凍存并不影響MSC促進(jìn)不同階段造血祖細(xì)胞增殖、分化的能力。
綜上所述，本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)：經(jīng)過(guò)中期和短期低溫凍存的骨髓MSC并不改變其固有的生物學(xué)特性。雖然凍存可以導(dǎo)致部分細(xì)胞損傷，但是并不影響剩余細(xì)胞的增殖能力和多向分化能力。此外，凍存后的MSC仍然具有支持造血的功能。但是，凍存后MSC是否在體內(nèi)仍具有上述生物學(xué)性狀和支持造血功能，尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。
【參考文獻(xiàn)】
1Jiang Y，Jahagirdar BN，Reinhardt RL，et al.Pluripotency of me-senchymal stem cell derived from adult marrow.Nature，2002; 418（6893）: 41-49
2Krause DS，Theise ND，Collector MI，et al.Multi-organ，multi-lineage engraftment by a single bone marrow-derived stem cell.Cell，2001; 105: 369-377
3Noort WA，Kruisselbrink AB，in’t-Anker PS，et al.Mesenchymal stem cells promote engraftment of human umbilical cord blood-derived CD34 (+) cells in NOD/SCID mice.Exp Hematol，2002; 30: 870-878
4Koc ON，Gerson SL，Cooper BW，et al.Rapid hematopoietic reco-very after coinfusion of autologous-blood stem cells and culture-expanded marrow mesenchymal stem cells in advanced breast cancer patients receiving high-dose chemotherapy.J Clin Oncol，2000; 18: 307-316
5Majumdar MK，Thiede MA，Mosca JD，et al.Phenotypic and functional comparison of cultures of marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs) and stromal cells.J Cell Physiol，1998; 176:57-66
[關(guān)鍵詞]血管;組織工程;細(xì)胞外基質(zhì);生物力學(xué)
[中圖分類號(hào)]R318[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A[文章編號(hào)]1008-6455(2010)07-0996-04
Effects of decellularization using biotic enzymes on the mechanical properties of the canine carotid artery
LIU Guo-feng1,HE Zhi-juan2,YANG Da-ping1,XU Xue-wu1,LIU Ying1,REN Li-hong1,LI Qing-chun1
(1.Department of Plastic Surgery,Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University,Harbin 150086,Heilongjiang,China; 2.Department of Obstetrics and Gynecology,First Affiliated Hospital of Harbin Medical University,Harbin 15001 0,Heilongjiang,China)
Abstract:ObjectiveThe objective of this study is to investigate the effects of decellularization using biotic enzymes on the mechanical and structural properties of the canine carotid artery.MethodsIntact canine carotid artery were decellularized by using Trypsin/EDTA,ribonuclease and desoxyribonuclease. Residual cellular and extracellular matrix composition was evaluated with hematoxylin and eosin (H&E) staining,quantitative DNA analysis and scanning electron microscopy. Tensile strength, burst strength and compliance were measured in vitro to determine the effects of decellularizedprocess on the biomechanical properties of the canine carotid artery.ResultsHistology and scanning electron microscopy examination demonstrate that scaffolds were completely decellularized and scaffolds revealed a well-preserved extracellular matrix. Compared with fresh canine carotid artery, decellularized artery had similar burst and breaking strength and had lower compliance.Conclusion This study demonstrates that the decellularized artery using biotic enzymes had similar burst and breaking strength and had lower compliance compared with fresh canine carotid artery.
Key words: vascular grafts; tissue engineering; extracellular matrix; biomechanical
血管組織工程學(xué)研究為臨床上小口徑血管移植物的制備提供了光明的前景,口徑小于6mm的小口徑組織工程血管研究與大口徑血管移植物的研究有很大的差別[1]。因?yàn)檠芤浦参锱c受區(qū)血管生物力學(xué)性質(zhì)的匹配程度對(duì)不同口徑的組織工程血管移植物通暢率的影響差別較大,血管移植物的口徑越小受到的影響越大,小口徑血管移植物在受體內(nèi)更容易發(fā)生內(nèi)膜增生、中膜增厚,最后導(dǎo)致移植物的官腔狹窄甚至閉塞[2]。血管組織工程研究中支架材料的力學(xué)性質(zhì)對(duì)血管移植物的生物力學(xué)性質(zhì)起著決定性的作用,所以在小口徑組織工程工程血管的研究中制備與受區(qū)血管生物力學(xué)性質(zhì)完全匹配的支架材料是最關(guān)鍵的科學(xué)問(wèn)題,這將決定小口徑組織工程血管移植的遠(yuǎn)期通暢率[3]。本實(shí)驗(yàn)將對(duì)小口徑組織工程血管脫細(xì)胞基質(zhì)生物支架材料的生物力學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究,明確生物酶聯(lián)合消化法對(duì)犬頸總動(dòng)脈脫細(xì)胞基質(zhì)材料生物力學(xué)的影響。
1材料和方法
1.1 實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物:普通雜種家犬,體重25～30kg,6個(gè)月齡,雌雄不限。
1.2 實(shí)驗(yàn)材料及主要儀器:胰蛋白酶(Trypsin)、核糖核酸酶(Ribonuclease,RNase)、脫氧核糖核酸酶(Desoxyribonu clease,DNase):美國(guó)Sigma公司;EDTA(Ethylenediamine tetraacetic acid)、磷酸緩沖鹽溶液(Phosphate buffer solution,PBS):北京中杉生物公司;普通光學(xué)顯微鏡:日本Nikon公司;S-3400N型掃描電子顯微鏡:日本Hitachi公司;電子萬(wàn)能實(shí)驗(yàn)材料機(jī):德國(guó)Zwick-Roell公司。
1.3 犬頸總動(dòng)脈脫細(xì)胞基質(zhì)材料制備: 無(wú)菌條件下切取犬頸總動(dòng)脈,大量無(wú)菌PBS沖洗,去除血液成分及外層附屬軟組織,選擇切取長(zhǎng)度約為7cm,內(nèi)徑約為3mm的動(dòng)脈,利用胰蛋白酶和核酸酶連續(xù)消化法去除動(dòng)脈細(xì)胞及其碎片成分[4]。先用0.1% 胰蛋白酶加0.02% EDTA 溶液消化20h,中間更換1次消化液,大量PBS沖洗后用20μg/ml RNase +200μg/ml DNase溶液消化2h,大量無(wú)菌PBS 溶液沖洗。以上步驟均在5%CO2、37℃,80次/ min持續(xù)震蕩條件下進(jìn)行。監(jiān)測(cè)制備的脫細(xì)胞血管基質(zhì),使材料的細(xì)胞DNA殘留量少于0.1%。同時(shí)選取新鮮犬頸總動(dòng)脈作為對(duì)照組(每組6例),進(jìn)行以下檢測(cè)。
1.3 組織學(xué)染色 將標(biāo)本置于10%中性甲醛溶液中固定24h,常規(guī)石蠟包埋、切片,進(jìn)行HE染色。在普通光學(xué)顯微鏡下對(duì)標(biāo)本的結(jié)構(gòu)進(jìn)行組織學(xué)評(píng)價(jià)照相。
1.4 掃描電鏡觀察 將標(biāo)本在1%戊二醛溶液中固定24h以上,用1%餓酸作后固定2h,50%、70%、90%、100%丙酮梯度脫水,50%、70%、90%、100%醋酸異戊酷置換,應(yīng)用臨界點(diǎn)干燥儀、液體C02等進(jìn)行干燥;干燥的標(biāo)本固定在鋁質(zhì)標(biāo)本臺(tái)上,用濺射鍍膜機(jī)鍍金后,用S-3400N型掃描電子顯微鏡系統(tǒng)觀察并照相。
1.5 生物力學(xué)檢測(cè):利用Zwick/Roell Z010型電子萬(wàn)能力學(xué)實(shí)驗(yàn)機(jī)測(cè)定標(biāo)本的拉伸強(qiáng)度、爆裂強(qiáng)度及軸向順應(yīng)性。拉伸強(qiáng)度及軸向順應(yīng)性檢測(cè):將管狀標(biāo)本(長(zhǎng)度為5cm)兩端固定于微型夾具上,以0.5mm/s的速度拉伸,直至標(biāo)本斷裂,系統(tǒng)自動(dòng)記錄標(biāo)本的應(yīng)力-應(yīng)變曲線及極限拉伸強(qiáng)度,計(jì)算出標(biāo)本的軸向順應(yīng)性。爆裂強(qiáng)度檢測(cè):把管狀標(biāo)本一端用絲線結(jié)扎,另一端固定于裝滿生理鹽水的5ml醫(yī)用注射器上,注射器筒壁固定于250ml玻璃葡萄糖瓶中,整個(gè)裝置平置在力學(xué)實(shí)驗(yàn)機(jī)上,以40kPa/s的力向標(biāo)本內(nèi)注射生理鹽水,直至標(biāo)本爆裂或漏液,系統(tǒng)自動(dòng)記錄標(biāo)本的爆裂強(qiáng)度。
1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析: 所有定量實(shí)驗(yàn)結(jié)果均用x±s表示,利用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),P
2結(jié)果
2.1大體所見(jiàn):犬頸總動(dòng)脈脫細(xì)胞基質(zhì)材料仍保持新鮮血管的管狀結(jié)構(gòu),血管的長(zhǎng)度及內(nèi)徑無(wú)明顯改變,材料外觀呈乳白色(圖1)。
2.2 組織學(xué)結(jié)構(gòu):新鮮犬頸總動(dòng)脈具有血管典型的三層結(jié)構(gòu):內(nèi)膜、中膜及外膜,中膜層較厚,包含大量的環(huán)狀排列藍(lán)染的細(xì)胞核成分和細(xì)胞外基質(zhì)成分(圖2A)。經(jīng)脫細(xì)胞處理后,血管壁中的藍(lán)染的細(xì)胞核成分全部去除,但脫細(xì)胞血管的細(xì)胞外基質(zhì)中纖維成分保存完整連續(xù),沒(méi)有發(fā)生斷裂破碎等。血管的中膜層結(jié)構(gòu)中可見(jiàn)細(xì)胞及部分細(xì)胞外基質(zhì)去除后遺留的空隙,同時(shí)血管內(nèi)外膜結(jié)構(gòu)的細(xì)胞外基質(zhì)成分保持完好(圖2B)。
2.3 掃描電鏡觀察:脫細(xì)胞犬頸總動(dòng)脈脫細(xì)胞基質(zhì)橫斷面的掃描電鏡照片可見(jiàn)大致的三層細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu),內(nèi)層見(jiàn)完整致密的內(nèi)彈性膜,中層可見(jiàn)成層環(huán)狀排列的纖維板層結(jié)構(gòu),纖維連續(xù),可見(jiàn)梭形空隙,材料外層可見(jiàn)雜亂排列的外膜層纖維條索組織(圖3A)。材料內(nèi)表面掃描電鏡照片顯示,材料的內(nèi)彈性膜纖細(xì)的纖維呈網(wǎng)狀分布,纖維完整,未見(jiàn)明顯斷裂缺失,透過(guò)纖維網(wǎng)可見(jiàn)深部中膜層較粗大的纖維(圖3B)。
2.4 生物力學(xué)性質(zhì):爆裂強(qiáng)度檢測(cè)結(jié)果如下,脫細(xì)胞犬頸總動(dòng)脈基質(zhì)組為315.00±12.49 KPa,新鮮犬頸總動(dòng)脈組為330.52±18.73 KPa,兩組標(biāo)本爆裂強(qiáng)度相似,差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖4)。極限拉伸強(qiáng)度檢測(cè)結(jié)果如下:脫細(xì)胞犬頸總動(dòng)脈基質(zhì)組為4 122.91±118.05 KPa,新鮮犬頸總動(dòng)脈組為4 212.99±103.80 KPa,兩組標(biāo)本極限拉伸強(qiáng)度相似,差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。軸向順應(yīng)性計(jì)算結(jié)果如下,脫細(xì)胞犬頸總動(dòng)脈基質(zhì)組為0.945±0.158 mm/mm,新鮮犬頸總動(dòng)脈組為1.195±0.22 mm/mm,脫細(xì)胞犬頸總動(dòng)脈基質(zhì)組軸向順應(yīng)性低于新鮮犬頸總動(dòng)脈組,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P
3討論
具有三維空間結(jié)構(gòu)的支架材料是構(gòu)建組織工程血管的基本要素之一,能為血管種子細(xì)胞生長(zhǎng)和組織發(fā)育提供臨時(shí)的支撐骨架,并能夠調(diào)控所構(gòu)建血管的形態(tài)。研制和開(kāi)發(fā)理想的支架材料仍然是血管組織工程所面臨的巨大挑戰(zhàn)。為了克服可降解高分子聚合物材料在生物相容性方面的不足,很多學(xué)者把研究目光轉(zhuǎn)移到了自然來(lái)源的生物支架材料上[5]。自然生物材料具有良好的生物相容性,能夠促進(jìn)細(xì)胞的黏附、生長(zhǎng)、增殖及生物功能的發(fā)揮。血管組織工程支架材料的發(fā)展趨勢(shì)是自然生物材料的應(yīng)用,自然生物材料是最有應(yīng)用潛力的組織工程支架材料來(lái)源[6]。血管脫細(xì)胞基質(zhì)材料的三維空間結(jié)構(gòu)與自然血管的結(jié)構(gòu)非常類似,因此具有理想的外形和適當(dāng)?shù)纳锪W(xué)性質(zhì),是血管組織工程學(xué)研究中較為理想的生物支架材料[7]。
正常血管的細(xì)胞外基質(zhì)成分包含膠原纖維、彈性蛋白及蛋白聚糖等成分,膠原纖維及彈性蛋白對(duì)于血管的強(qiáng)度起關(guān)鍵性的作用。膠原纖維具有良好的抗張強(qiáng)度,對(duì)于維持血管的完整性具有重要意義,彈性蛋白和蛋白聚糖有一定的彈性,能夠使血管具有良好的順應(yīng)性[8]。研究表明,脫細(xì)胞處理會(huì)改變血管原有的生物力學(xué)性質(zhì),特別是材料的順應(yīng)性常會(huì)降低[9]。本實(shí)驗(yàn)利用生物酶連續(xù)消化法制備的犬頸總動(dòng)脈脫細(xì)胞基質(zhì)材料在去除了細(xì)胞及DNA殘留物的同時(shí),細(xì)胞外基質(zhì)的纖維成分保持完整連續(xù),所以脫細(xì)胞材料的拉伸強(qiáng)度和爆裂強(qiáng)度與新鮮血管相似。除膠原纖維和彈性蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)纖維成分外,蛋白聚糖成分在脫細(xì)胞處理過(guò)程中常會(huì)遭到破壞,蛋白聚糖的去除對(duì)于脫細(xì)胞血管的拉伸強(qiáng)度和爆裂強(qiáng)度沒(méi)有明顯的影響,但會(huì)使材料的彈性降低變硬,生物力學(xué)的表現(xiàn)是材料的順應(yīng)性下降[10]。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn),經(jīng)過(guò)生物酶連續(xù)消化脫細(xì)胞處理,脫細(xì)胞犬頸總動(dòng)脈基質(zhì)材料的軸向順應(yīng)性有所降低,從組織學(xué)觀察可以看出,脫細(xì)胞后血管橫斷面膠原纖維和彈性蛋白等纖維條索中間出現(xiàn)很多梭形空隙,這些空隙是由于中膜內(nèi)平滑肌細(xì)胞及蛋白聚糖的去除而形成的,因此,脫細(xì)胞犬頸總動(dòng)脈的軸向順應(yīng)性與新鮮血管相比有所降低。
組織工程血管的拉伸強(qiáng)度、爆裂強(qiáng)度的順應(yīng)性是重要的生物力學(xué)力學(xué)評(píng)價(jià)指標(biāo),足夠的拉伸強(qiáng)度和爆裂強(qiáng)度能夠保證血管移植后能夠抵抗長(zhǎng)期的血液動(dòng)力學(xué)作用而不形成動(dòng)脈瘤。而對(duì)于小口徑組織工程血管移植物,順應(yīng)性與拉伸強(qiáng)度和爆裂強(qiáng)度相比顯得更為重要,小口徑血管移植物和受區(qū)血管之間的順應(yīng)性要匹配,這是移植物長(zhǎng)期成功的重要保證[11-12]。血管移植物與受區(qū)血管之間的順應(yīng)性等力學(xué)性質(zhì)錯(cuò)配會(huì)導(dǎo)致血流動(dòng)力學(xué)的變化,血流方向改變、剪切力增加、下游血流紊亂、循環(huán)張力改變,從而引起吻合口處的應(yīng)力集中,刺激內(nèi)膜增生的生長(zhǎng)因子的釋放增加,促進(jìn)了血栓的形成和新內(nèi)膜的增生,最終導(dǎo)致血管移植物長(zhǎng)期通暢率明顯降低[13-14]。脫細(xì)胞處理經(jīng)常會(huì)導(dǎo)致血管細(xì)胞外基質(zhì)材料順應(yīng)性的降低,從而影響構(gòu)建的小口徑組織工程血管與受區(qū)血管生物力學(xué)性質(zhì)的匹配,導(dǎo)致移植失敗,所以提高以脫細(xì)胞血管基質(zhì)為支架材料的小口徑組織工程血管的順應(yīng)性是組織工程血管研究的瓶頸問(wèn)題?？赡艿慕鉀Q方案包括:(1)改進(jìn)完善脫細(xì)胞血管基質(zhì)材料的制備方法,在保證血管細(xì)胞成分完全去除的前提下盡量保留細(xì)胞外基質(zhì)材料原有的生物力學(xué)性質(zhì);(2)通過(guò)在脫細(xì)胞血管基質(zhì)材料上復(fù)合某種其他材料制備順應(yīng)性良好的復(fù)合支架材料;(3)在體外利用脫細(xì)胞血管支架材料構(gòu)建組織工程血管的過(guò)程中促使平滑肌細(xì)胞分泌大量新生細(xì)胞外基質(zhì)成分,以增加組織工程血管的順應(yīng)性。
[參考文獻(xiàn)]
[1]Isenberg BC,Williams C,Tranquillo RT.Small-diameter artificial arteries engineered in vitro[J]. Circ Res,2006,98(1):25-35.
[2]Wang X,Lin P,Yao Q,et al. Development of small-diameter vascular grafts[J]. World J Surg,2007,31(4):682-689.
[3]Tiwari A,Cheng KS,Salacinski H,et al. Improving the patency of vascular bypass grafts: the role of suture materials and surgical techniques on reducing anastomotic compliance mismatch[J]. Eur J Vasc Endovasc Surg,2003,25(4):287-295.
[4]劉國(guó)鋒,楊大平,郭鐵芳,等. 小口徑組織工程血管脫細(xì)胞生物支架材料的研究[J]. 中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐,2008,14(3): 234-236,301.
[5]Stegemann JP,Kaszuba SN,Rowe SL. Review: advances in vascular tissue engineering using protein-based biomaterials[J]. Tissue Eng,2007,13(11):2601-2613.
[6]Meredith JE Jr,Fazeli B,Schwartz MA. The extracellular matrix as a cell survival factor[J]. Mol Biol Cell,1993,4(9): 953-961.
[7]Schmidt CE,Baier JM. Acellular vascular tissues: natural biomaterials for tissue repair and tissue engineering[J]. Biomaterials,2000,21(22):2215-2231.
[8]MacNeill BD,Pomerantseva I,Lowe HC,et al. Toward a new blood vessel[J]. Vasc Med,2002,7(3):241-246.
[9]Amiel GE, Komura M,Shapira O,et al. Engineering of blood vessels from acellular collagen matrices coated with human endothelial cells[J]. Tissue Eng,2006,12(8):2355-2365.
[10]Courtman DW, Pereira CA, Kashef V. Development of a pericardial acellular matrix biomaterial: biochemical and mechanical effects of cell extraction[J]. J Biomed Mater Res,1994,28:655-666.
[11]Ballyk PD, Walsh C, Butany J,et al. Compliance mismatch may promote graft-artery intimal hyperplasia by altering suture-line stresses[J]. J Biomech, 1998,31(3):229-237.
[12]Abbott WM, Megerman J,Hasson JE,et al. Effect of compliance mismatch on vascular graft patency[J]. J Vasc Surg,1987,5(2):376-382.
[13]Howard AB,Alexander RW,Nerem RM,et al. Cyclic strain induces an oxidative stress in endothelial cells[J]. Am J Physiol,1997,272(2 Pt 1):C421-427.
一、精選教材
教材是課程知識(shí)內(nèi)容的載體，是進(jìn)行教學(xué)活動(dòng)的基本材料之一[2，3]。如何選擇和使用教材對(duì)教學(xué)任務(wù)的實(shí)施、完成和對(duì)教學(xué)質(zhì)量的影響至關(guān)重要。通過(guò)對(duì)相關(guān)院校的走訪、大量資料的查閱以及結(jié)合本校水產(chǎn)養(yǎng)殖學(xué)科的專業(yè)特點(diǎn)、課程學(xué)時(shí)數(shù)以及授課對(duì)象，最終確定以翟中和等主編的《細(xì)胞生物學(xué)》為教學(xué)用教材，并及時(shí)跟進(jìn)該書(shū)的新版本。在應(yīng)用該教材的同時(shí)，特別注重其他教科書(shū)的參考和補(bǔ)充，如將王金發(fā)編著的《細(xì)胞生物學(xué)》、王堃仁等主編的《細(xì)胞生物學(xué)》、鄭國(guó)锠等主編的《細(xì)胞生物學(xué)》、Alberts主編的《Molecular Biology of the Cell》等作為本課程的參考教科書(shū)。此外，教師在備課過(guò)程中還注重尋求教科書(shū)之外的教學(xué)資源，如國(guó)內(nèi)外重要學(xué)術(shù)期刊、國(guó)內(nèi)外知名大學(xué)《細(xì)胞生物學(xué)》課程網(wǎng)站，特別是國(guó)外互聯(lián)網(wǎng)站上與細(xì)胞生物學(xué)知識(shí)相關(guān)的網(wǎng)絡(luò)資源。教學(xué)中將教材、參考教科書(shū)以及教科書(shū)之外的教學(xué)資源相互補(bǔ)充和凝練，力求教學(xué)內(nèi)容的系統(tǒng)性和前瞻性。
二、教學(xué)內(nèi)容的遴選
《生物化學(xué)》、《遺傳學(xué)》、《細(xì)胞生物學(xué)》和《生理學(xué)》等是水產(chǎn)學(xué)院重要的學(xué)科基礎(chǔ)課。這些課程在內(nèi)容上聯(lián)系極為密切，相互交叉和滲透。在《細(xì)胞生物學(xué)》課程的教學(xué)中，既要避免本課程與其他課程內(nèi)容的過(guò)度重復(fù)又要保證授課內(nèi)容的完整性、體現(xiàn)細(xì)胞生物學(xué)的核心內(nèi)容。根據(jù)水產(chǎn)學(xué)院的教學(xué)安排以及授課學(xué)生的實(shí)際情況，在《細(xì)胞生物學(xué)》理論課教學(xué)中對(duì)所用教材的內(nèi)容進(jìn)行遴選，合理取舍與合并，最終形成十章作為本校水產(chǎn)養(yǎng)殖學(xué)科《細(xì)胞生物學(xué)》理論課教學(xué)內(nèi)容，即：“緒論”、“細(xì)胞的基本知識(shí)”、“細(xì)胞生物學(xué)的主要研究方法”、“細(xì)胞表面”、“細(xì)胞基質(zhì)和內(nèi)膜系統(tǒng)”、“線粒體”、“細(xì)胞骨架”、“細(xì)胞核與染色體”、“細(xì)胞周期和細(xì)胞的分裂與分化”和“細(xì)胞的衰老與凋亡”?！都?xì)胞生物學(xué)》理論課的教學(xué)內(nèi)容遴選后，授課中以細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能為主線，從顯微、亞顯微和分子水平闡述細(xì)胞結(jié)構(gòu)，特別是結(jié)構(gòu)與功能的相關(guān)性，認(rèn)識(shí)細(xì)胞重要生命活動(dòng)的基本內(nèi)容和本質(zhì)，掌握細(xì)胞生物學(xué)的基本概念和基礎(chǔ)理論，在《生物化學(xué)》、《遺傳學(xué)》和《生理學(xué)》課程學(xué)習(xí)的基礎(chǔ)之上，通過(guò)《細(xì)胞生物學(xué)》的教學(xué)，使學(xué)生的知識(shí)體系更加系統(tǒng)化、深入化。
三、調(diào)整與優(yōu)化教學(xué)內(nèi)容，因材施教，提高教學(xué)效果
由于課堂教學(xué)仍然是在校學(xué)生獲取知識(shí)的主要形式[4]，因此教學(xué)內(nèi)容確定后，教師要梳理每一章的教學(xué)內(nèi)容，清晰講授的重點(diǎn)和應(yīng)達(dá)到的具體教學(xué)目的。首先，教師要意識(shí)到第一次課的重要性，它對(duì)激發(fā)學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣有著重要的作用。與其他課程一樣，課程的講授內(nèi)容通常以緒論開(kāi)篇。但是，不僅許多學(xué)生不重視緒論的內(nèi)容，教師也容易出現(xiàn)缺乏對(duì)緒論講授的激情[5]。教學(xué)中我們將教材[1]中緒論的內(nèi)容重排、調(diào)整與優(yōu)化，收到了較好的教學(xué)效果。授課中將細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展簡(jiǎn)史作為最先講授的內(nèi)容，并結(jié)合一些與之相關(guān)的逸聞趣事，激發(fā)學(xué)生對(duì)該門(mén)課程學(xué)習(xí)的興趣，使學(xué)生在輕松的氛圍中了解學(xué)科的誕生、認(rèn)識(shí)學(xué)科的發(fā)展與實(shí)驗(yàn)儀器和技術(shù)進(jìn)步的關(guān)系；通過(guò)介紹“細(xì)胞學(xué)說(shuō)”的建立，不僅使學(xué)生掌握了該學(xué)說(shuō)的基本原理，還使學(xué)生意識(shí)到善于點(diǎn)滴積累以及歸納和總結(jié)對(duì)學(xué)習(xí)和工作的重要性，通過(guò)上述學(xué)習(xí)學(xué)生們也弄清了細(xì)胞生物學(xué)最基本的研究?jī)?nèi)容。之后再介紹當(dāng)今細(xì)胞生物學(xué)的主要研究?jī)?nèi)容和研究熱點(diǎn)，并將教材目錄與緒論的內(nèi)容相聯(lián)系，這樣不僅使細(xì)胞生物學(xué)的研究?jī)?nèi)容深記于學(xué)生的腦海中，也便于他們對(duì)本課程后續(xù)內(nèi)容的學(xué)習(xí)和提高學(xué)習(xí)的信心。其次，授課內(nèi)容的順序編排要便于學(xué)生與已掌握的有關(guān)知識(shí)相銜接。根據(jù)授課對(duì)象的實(shí)際情況，教學(xué)中按著細(xì)胞的組織結(jié)構(gòu)從外向內(nèi)，即：細(xì)胞表面→細(xì)胞質(zhì)→細(xì)胞核的順序，并將結(jié)構(gòu)或功能上聯(lián)系極為密切的細(xì)胞結(jié)構(gòu)的知識(shí)放在一起講授。以本課程的“細(xì)胞表面”與“細(xì)胞基質(zhì)和內(nèi)膜系統(tǒng)”兩章為例，對(duì)教材以及相關(guān)的教科書(shū)中的有關(guān)內(nèi)容做了較大的調(diào)整，重新編排與優(yōu)化。授課時(shí)“細(xì)胞表面”一章，首先介紹細(xì)胞表面的結(jié)構(gòu)組成（質(zhì)膜、細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞外被、細(xì)胞表面的特化結(jié)構(gòu)細(xì)胞連接），各結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)、功能以及這些結(jié)構(gòu)的相互關(guān)系；通過(guò)這樣的講授使學(xué)生清楚地知道多細(xì)胞生物中雖然所有的細(xì)胞都具有“質(zhì)膜”這樣一個(gè)界膜，它是細(xì)胞表面核心結(jié)構(gòu)，但多細(xì)胞生物不僅由細(xì)胞構(gòu)成，細(xì)胞外還有細(xì)胞外基質(zhì)，同時(shí)沒(méi)有一個(gè)細(xì)胞是孤立的，細(xì)胞與細(xì)胞或與細(xì)胞外基質(zhì)形成特定的組織連接結(jié)構(gòu)，從而使多細(xì)胞生物成為一個(gè)和諧的統(tǒng)一體。之后再詳盡地介紹細(xì)胞表面核心結(jié)構(gòu)——質(zhì)膜的物質(zhì)的運(yùn)輸和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能，通過(guò)這部分的學(xué)習(xí)又使學(xué)生對(duì)膜的不對(duì)稱性和流動(dòng)性有了更好的理解。此外，由于核糖體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在功能上的關(guān)系極為密切，因此將核糖體并入內(nèi)膜系統(tǒng)中介紹，形成本課程的“細(xì)胞基質(zhì)和內(nèi)膜系統(tǒng)”一章。授課中首先講解非膜性細(xì)胞器——核糖體在細(xì)胞中的分布、化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)以及功能，之后介紹內(nèi)膜系統(tǒng)中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體和溶酶體的超微結(jié)構(gòu)與功能，但內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體的蛋白質(zhì)加工功能與蛋白質(zhì)的分揀形成本章獨(dú)立的一節(jié)，即“蛋白質(zhì)的分揀與加工”，內(nèi)容包含信號(hào)假說(shuō)、蛋白質(zhì)的修飾與加工、蛋白質(zhì)的分揀和膜泡運(yùn)輸，此節(jié)為本章的教學(xué)重點(diǎn)之一。介紹信號(hào)假說(shuō)時(shí)，由于有了核糖體的知識(shí)基礎(chǔ)，再結(jié)合具體的研究成果，學(xué)生則很容易理解分泌性蛋白的合成在細(xì)胞基質(zhì)中起始、肽鏈延伸暫停、向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移等信號(hào)假說(shuō)的具體內(nèi)容；通過(guò)本節(jié)其他知識(shí)內(nèi)容的學(xué)習(xí)，清晰了蛋白質(zhì)的修飾加工可發(fā)生在肽鏈的合成以及運(yùn)輸過(guò)程中，因此構(gòu)成了蛋白質(zhì)合成、加工與運(yùn)輸?shù)耐暾w系。此外，將溶酶體的發(fā)生也獨(dú)立成節(jié)，放在“蛋白質(zhì)的加工與分揀”一節(jié)之后，以溶酶體酶的M6P分揀途徑為例，將信號(hào)假說(shuō)、蛋白質(zhì)的加工與分揀以及膜泡運(yùn)輸?shù)牟糠謨?nèi)容串聯(lián)起來(lái)。通過(guò)上述講授內(nèi)容的遴選、調(diào)整與優(yōu)化，也使學(xué)生對(duì)結(jié)構(gòu)、功能、發(fā)生上相互關(guān)聯(lián)的內(nèi)膜系統(tǒng)的理解更加透徹。再次，根據(jù)教學(xué)時(shí)數(shù)適當(dāng)安排自學(xué)與課后討論的教學(xué)內(nèi)容，培養(yǎng)學(xué)生自主和探究學(xué)習(xí)的能力。如“細(xì)胞生物學(xué)的主要研究方法”一章，不可能在有限的學(xué)時(shí)內(nèi)將該部分內(nèi)容講透徹，因此該部分內(nèi)容以學(xué)生自學(xué)、課下參觀相關(guān)的儀器設(shè)備及與教師交流討論的形式實(shí)現(xiàn)學(xué)生對(duì)該部分知識(shí)的獲??；此外根據(jù)授課專業(yè)特點(diǎn)，葉綠體的知識(shí)也以學(xué)生自學(xué)和課下與老師交流的方式進(jìn)行。最后，注重講授內(nèi)容與其他課程內(nèi)容上既不過(guò)度重復(fù)又要較好地銜接。如在講授質(zhì)膜的功能——鈉鉀泵的知識(shí)時(shí)注意與《生理學(xué)》膜電位的知識(shí)相聯(lián)系、細(xì)胞骨架中微絲的功能時(shí)注重與《生理學(xué)》以及《組織胚胎學(xué)》肌肉收縮內(nèi)容的銜接，線粒體功能的講解則考慮與《生物化學(xué)》的內(nèi)容不過(guò)度重復(fù)和較好的銜接，而細(xì)胞核與染色體的知識(shí)需要考慮學(xué)生在《遺傳學(xué)》課程上已掌握的知識(shí)。由于本課程的開(kāi)設(shè)在上述幾門(mén)課程之后，這就要求我們與上述課程的任課教師以及授課學(xué)生良好的溝通，適當(dāng)調(diào)整本課程的授課內(nèi)容與重點(diǎn)，從而使學(xué)生通過(guò)《細(xì)胞生物學(xué)》課程的學(xué)習(xí)，使他們知識(shí)體系更加系統(tǒng)化、深入化。
由于細(xì)胞生物學(xué)的知識(shí)面廣、信息量大、發(fā)展快，因此教學(xué)內(nèi)容的改革是教學(xué)改革最重要的部分。結(jié)合我校水產(chǎn)養(yǎng)殖學(xué)科的專業(yè)特點(diǎn)和授課對(duì)象的實(shí)際情況，對(duì)《細(xì)胞生物學(xué)》理論課的教學(xué)內(nèi)容進(jìn)行遴選、調(diào)整重排與優(yōu)化，并且應(yīng)用于《細(xì)胞生物學(xué)》的教學(xué)中，提高了教學(xué)效果。此外，通過(guò)多年的教學(xué)實(shí)踐我們深深地體會(huì)到，完成好教學(xué)內(nèi)容，教師尤其要注重自身知識(shí)理論水平的提高，不斷地豐富教學(xué)內(nèi)容，才能不斷提高教學(xué)效果與教學(xué)質(zhì)量。
參考文獻(xiàn)：
[1]張晶，華子春.細(xì)胞生物學(xué)課程體系優(yōu)化的實(shí)踐與思考[J].中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào)，2011，33（6）：716-719.
