序言：寫作是分享個人見解和探索未知領域的橋梁，我們?yōu)槟x了8篇的離職感謝信樣本，期待這些樣本能夠為您提供豐富的參考和啟發(fā)，請盡情閱讀。

第1篇

你好！你好！

首先，公司代表全休同仁衷心向你和你的家人表示感謝！首先，公司代表全休同仁衷心向你和你的家人表示感謝！感謝你在公司任職期間的兢表示感謝兢業(yè)業(yè)、默默奉獻！感謝你對____的認可與信賴！感謝你對____的忠誠和敬業(yè)！感兢業(yè)業(yè)、默默奉獻！的認可與信賴！的忠誠和敬業(yè)！付出的辛勤和汗水！謝你對____付出的辛勤和汗水！

可能是因為公司平臺及發(fā)展方向與你個人對未來規(guī)劃暫時不能保持一致，可能是因為公司平臺及發(fā)展方向與你個人對未來規(guī)劃暫時不能保持一致，而讓你選擇離開你曾為之奮斗的工作崗位。但是我們相信，離開你曾為之奮斗的工作崗位。但是我們相信，在____這些日子的成長能讓你比昨天更自信、朋友更多、笑容更美！在未來的日子里，因為你的努力拼搏、自信、朋友更多、笑容更美！在未來的日子里，因為你的努力拼搏、踏實肯干的精神讓你在任何崗位都能成就不平凡的事業(yè)，無論是在工作中或生活中，你都是最優(yōu)秀的！在任何崗位都能成就不平凡的事業(yè)，無論是在工作中或生活中，你都是最優(yōu)秀的！

作中或生活中優(yōu)秀員工是企業(yè)的財富，當你決定離開時，我們的心里都有一種說不出的感受-----優(yōu)秀員工是企業(yè)的財富，當你決定離開時，我們的心里都有一種說不出的感受-----是遺憾！是惋惜！是祝福！但是天下沒有不散的筵席，我們衷心祝福你：家庭和睦，是遺憾！是惋惜！是祝福！但是天下沒有不散的筵席，我們衷心祝福你：家庭和睦，健康幸福！同時請你記住：公司全體伙伴非常高興地歡迎你有時間?；丶铱纯?，幸福！同時請你記?。汗救w伙伴非常高興地歡迎你有時間?；丶铱纯矗Ｍ隳馨旬敵赡阌肋h的“娘家”____當成你永遠的“娘家”！

再次向你和你的家人表示真摯的感謝和深深的祝福！再次向你和你的家人表示真摯的感謝和深深的祝福！此致敬禮

你好！

你在公司服務整整一年，一年，就漫長的人類世界來說，也許只是短暫的一瞬，但就個人而言，也算不短的歲月。

在你提出離職的那一刻，我有種酸酸的感覺，畢竟，我不只一次跟你們說，大家一起努力，共同退休。

但你因為個人發(fā)展，在勞動合同到期的那一天，選擇離開服務過365天的瀟湘文化，真有一種說不出的滋味。

就設計能力而言，你并不占優(yōu)勢，但你忠厚坦誠、任勞任怨，在這物欲橫流的社會，是難得的美德。所以，我一直非常喜歡你。

不知你以后會做些什么，希望以你的美德去感染更多愿意支持與幫助你的人，焉知，人格魅力才是人生發(fā)展最大的銳器。

你已經離開公司了，我將這封遲到的感謝信發(fā)給你哥哥，希望他轉交給你，真誠感謝你為公司所做的艱辛付出，瀟湘文化永遠不會忘記你的功勞。方便的時候，?；亍凹摇笨纯础?/p>

謹祝

事業(yè)有成、幸福平安！

小__：

當得知你由于諸多的個人原因不得不選擇離開公司時，做為總經理，我心里有一種說不清的感受——是遺憾，是惋惜，是祝福？我想三者都有！

做為一名老員工，你在公司工作了三年半，伴隨著企業(yè)走過了許多風雨。三年半來，你從一名普通員工成長為一名稱職的基層管理人員和優(yōu)秀員工，這里面有企業(yè)為你創(chuàng)造的條件和機會，更有你自己辛勤的努力和付出。為什么能從一名普通員工成長為優(yōu)秀員工？正如你說的那樣：“每天都想著把每一件事做好，認真關注每一個細節(jié)”，承擔責任，默默地為企業(yè)奉獻。在此，我代表公司向你致以誠摯的謝意！感謝你對企業(yè)的認可和信賴！感謝你對企業(yè)的忠誠和敬業(yè)！感謝你為企業(yè)付出的辛勞和汗水！感謝你讓自己的青春在××公司閃光！

第2篇

大家好!今天我懷著依依不舍的心情寫下這封信，俗話說：人生沒有不散的宴席。今天選擇離開這個我生活與工作了五年的地方，并不是因為公司給予我的太少，也不是待遇問題?；仡櫸迥?，公司給予我的實在是太多太多，自己在公司也盡了自己微薄的力量。選擇離開是覺得在公司這個美好的平臺上，自己就像是溫室里的花朵，必須到外面經歷風雨才能茁壯成長，也許會碰得頭破血流，但也是人生中的一段精彩的回憶。

首先非常感謝公司給了我一個很好的工作平臺，以及在職的五年里對我的栽培和關懷，讓我在任何時候內心都洋溢著感激之情，我從畢業(yè)來到新邦，作為新邦發(fā)展壯大的見證人，內心無比的驕傲，一路走來，收獲了太多太多，都是新邦給我的，但是由于個人原因，不能為公司輝煌的明天繼續(xù)貢獻自己微薄的力量，為此感到深深的歉意。

在職的這些時間里，我從一個懵懂少年學會了物流的專業(yè)知識，學會了客戶談判、學會了管理技能，公司給予了我實現自身價值的機會，使我不斷的成長，積累了工作的經驗，學會了為人處世的道理，所有的這些都是我所珍惜的，帶給我工作和生活中很大的幫助，感恩新邦，感謝石總、感謝袁總、感謝楊總、感謝程總、感謝艾總、感謝梁總、感謝呂總，感謝所有幫助與支持過我的同事和朋友。

在新邦的日子是充實而且快樂的，與優(yōu)秀的新邦人成為同事，一起共事，讓我受益匪淺，并且也將深深的影響我，我誠摯的感謝大家，因為你們讓我成長，成熟，在朝夕相處的時間里建立的深深的友誼，是我一輩子的財富。

千言萬語還是一句感謝，感謝過去的五年新邦給予我的栽培，感謝領導給我的幫助，感謝同事給我的支持。衷心的祝福公司的規(guī)模不斷的擴大，業(yè)績不斷的提升，祝愿公司領導以及各位同事工作順利，生活愉快!

第3篇

說來也奇怪，每個月我拿到雜志的第一件事，不是像其他同學一樣先看笑話或是美文，而總是一本正經地研究起“封面人物”來，順便把自己和他們作一番比較：這個姑娘腿好長，我也是大長腿呀；這個姑娘好美，我的顏值也能入大家法眼吧；這個帥哥成績真好，我的成績也不賴……不知道為什么，對于封面人物，我總是有一種既佩服又不服的心理。

直到某期封面上刊登了一個我們衢州的姑娘時，我第一次有一種原來自己離封面人物那么近的感覺。我終于按捺不住內心的“洪荒之力”，鼓起勇氣把自己的照片放上了銳角網。

頭幾天，每天回家我都會打開電腦，看看有沒有人評論?！皠傞_始看的人不多，很正常?！蔽疫@樣安慰自己。又過了幾天，有消息提示跳出來，我心里一陣狂喜，是不是有人來為我加油了，還是小編看到我了？我迫不及待地點開了頁面，回復不多，當中卻夾雜著好幾條負面評論。我的心情一下子從云端墜入了谷底。雖說“勝敗乃兵家常事”，但我還是有一些失落。從那之后，我便沒有登錄過銳角網了。

直到有一天?！皟z儂，你把照片放到網上去了？”媽媽接完一個電話后疑惑地問我，“《中學生天地》的編輯說你成功入選封面人物了，這是不是真的？”

真的真的！我激動極了，趕緊跟爸媽解釋這件事情的前因后果，媽媽終于相信了她女兒的魅力，還神神秘秘地跟我說了件事，可把我逗樂了――原來《中學生天地》的編輯在打電話之前就發(fā)過一條短信，但謹慎的媽媽竟然直接把它當成了詐騙短信。而我爸爸是個特別愛N瑟而且自戀的人，這一點我可能有點隨他。他的反應與媽媽完全不同，簡直是高興得不要不要的，就差沒當天晚上就把我送去拍照了。

拍攝那天是1月31日，日子我記得很清楚，因為那天剛好也是我八年級上的休業(yè)式，我果斷跟老師請了假，老師也果斷準了。

一路上我都特別悠閑自在地躺在車后座，還瞇了一小會兒，然而快到拍攝的地方時，我突然開始坐立不安了。攝影師朝我走過來的時候，是我最最緊張的時刻。他先是笑著的，然后突然皺起了眉頭，短短的一兩秒鐘，我卻覺得特別漫長，然后就聽到他十分憂傷地說：“你怎么那么高??？你媽媽說你只有1米55呀，哎呀，那我買的衣服你穿不下怎么辦？”后來才知道，他這么說只是為了緩解我的緊張。攝影師的形象瞬間從“高冷藝術家”直接降到了“嘮叨歐吉桑”。

那天，天特別冷（回家的路上還下起了雪），而我要穿著和三月號封面相符的春天的衣服，在凜冽寒風中，擺出各種pose，臉上表情還不能太僵硬。雖然我很機智地在身上貼了好幾個暖寶寶，但還是要靠跺腳和搓手來取暖，瞬間有點同情起大冬天走紅毯的女明星們。

剛開始拍攝的時候還有點緊張，手不知道該怎么擺，眼睛不知道該看哪兒，不過攝影師叔叔很專業(yè)，他一直在調動我的情緒，還親自示范擺姿勢。拍著拍著，攝影師突然跟我說：“好的，很好，你把剛才的動作再做一遍?！毕乱幻?，大家就都笑趴在了地上――我以為攝影師要我半瞇著眼去看放大鏡，還想這么丑的表情真的好看嗎。據我媽媽的描述，當時的畫面就像是一個中年大叔很努力地把眼睛瞇起來，要看清楚路邊的美女一樣，特猥瑣。一陣笑聲過后，我變得放松多了。

那期雜志社策劃的選題是“教室里的福爾摩斯”，衣服的搭配很有名偵探范兒，特別酷。后來又換了一套紅黑格子裙，化妝師姐姐還幫我換了一個發(fā)型，我可算是好好地過了一把模特癮！

每一時間點都巧合地讓“上封面”這件事給我留下難以磨滅的印象，就像是休業(yè)式那天請假去拍攝，又比如期中考試出成績的那天拿到了三月號雜志。

第4篇

你們好!

凝聚歲月，四個月多的頂崗支教實習時間悄然從指間劃過如白駒過隙。初來時，還是咋暖還寒的二月，可離別之時已是烈日炎炎的六月。至此，回想起來這一切的一切就好像是昨天剛發(fā)生的事一樣。

回望當時來XX中學時，一切都是未知的，對自己將來在這里一學期的生活、工作具體那么多的不確定。擔心不能很好地適應智力的高中生活;擔心學校不會給我們安排上課以及自己生活上的問題，總之一切的一切都處在擔心之中。后來證明我們擔心地這一切都不從在。雖然達到時是寒冷的二月，但到達XX一后，就有老師帶領去熟悉宿舍以及我們的生活問題也得到了解決，可以說初來時的一切都很順利，也讓我們感到溫暖。

接著給我們介紹了兩位指導老師，也就是我的兩位師父，劉老師與郝老師。雖然第一次見面，但總覺得我的師父是那么的和藹可親。劉老師是一個細心的人不僅僅對我的教學進行指導，更是對我們的生活無微不至的關懷。郝老師是一位知識淵博，有幽默感的老師?？傊?，這四個多月的實習過程中兩位師父總是不忘關心我們在生活當中有什么難處。除此之外，剛開始以為我們是實習老師，辦公室里的其他老師會冷漠我們，可事實剛好相反，辦公室里的老師非常友好，而且他們也多次地幫助我們。再次，只能用自己綿薄的語言給他們說一聲謝謝。

第5篇

【關鍵詞】 產后出血；子宮摘除；護理；心理干預

【中圖分類號】R635 【文獻標識碼】B 【文章編號】1005-0515(2011)06-0115-01

胎兒娩出后24小時內出血量超過500ml者稱產后出血。產后出血是分娩晚期嚴重并發(fā)癥，至今仍居我國孕產婦死亡原因的首位[1]。對產科不可控制的出血，適時切除子宮是搶救產婦生命最重要的手段，但對產婦的心理健康會有一定的影響，應積極的進行心理干預和支持?，F將我院2010年收住的一名患者因產后出血經各種方法處理無效，最后行子宮切除的病例進行回顧性分析，患者經術中、術后心理干預措施和積極有效護理獲得痊愈，現將護理體會報告如下。

1 臨床資料

1.1一般資料：患者：女，28歲，經產婦，兩年前產一子，剖宮產。今孕周39周，胎兒巨大，5.3kg，宮縮乏力。

1.2 手術方式：剖宮產術后即行子宮切除術。

1.3 出血量及輸血量：手術出血量2000毫升，輸血1600毫升。

1.4 結果：住院13天，切口愈合良好，痊愈出院。

2 護理

2.1 搶救與護理:產后出血會在短時間內失去大量血液，造成產婦血容量不足，迅速進入休克、DIC，甚至發(fā)生不可逆的器質性損害，所以搶救必須爭分奪秒。

2.1.1 建立靜脈通道:積極配合醫(yī)生快速建立靜脈輸液通道3條，以便輸液、輸血。靜脈穿刺選擇20號針頭(用三通管套管針)。給予輸液輸血，補充血容量，力爭在1～4小時改善微循環(huán)，保證重要器官的供血，補充凝血因子，防治DIC。

2.1.2 防止腦缺氧:產婦取平臥位，保證腦部供血，正壓輸氧，減輕腦水腫，防止腦缺氧。保持呼吸道通暢，做好口腔護理，預防呼吸道感染。

2.1.3 持續(xù)監(jiān)測產婦的生命體征，測定中心靜脈壓，指導輸液。

在止血及補充血容量的同時，積極查找出血原因，正確使用宮縮劑，及時給予止血藥物，根據出血的不同原因，做好相應的處理和護理。注意保暖(最好不使用熱水袋)，正確記錄尿量，遵醫(yī)囑準確及時靜滴肝素并維持一定血藥濃度。做好各項搶救護理記錄。術中嚴密觀察生命體征變化，保證靜脈通道通暢。

2.1.4 心理護理:術中鼓勵、安慰患者，給予心理支持，使患者主動配合治療。

2.2 術后護理:

2.2.1 術后繼續(xù)嚴密觀察生命體征的變化，做好特護記錄。

體溫>39 ℃予以降溫，冷敷或灑精擦浴，以減少耗氧量。同時，保持尿道通暢，防止管脫落、變壓、扭曲，觀察尿量、顏色及性質。患者陰道流血情況在切除宮體后逐漸好轉。加強基礎護理，保持病房環(huán)境安靜舒適，積極協助患者變換，預防腹部手術后腸粘連、腸梗阻的發(fā)生。

2.2.2 心理干預:產后失血的強烈刺激，搶救措施的頻繁而緊急，各種搶救儀器的使用，加之醫(yī)務人員之間嚴肅的神情，失去子宮所面臨的諸多問題，這些突況易使患者惑到自已面臨死亡的威脅，進而產生恐懼、緊張、頻躁不安的心理。在護理中盡量做到有一名護士始終伴隨左右，及時告知她有關信息。并且醫(yī)護人員保持鎮(zhèn)靜的工作態(tài)度，忙而不亂，注意保護性醫(yī)療措施以穩(wěn)定患者情緒。待子宮切除的手術做完，病情穩(wěn)定后，患者往往會因失去子宮而暗自飲泣，流露出今后的路該怎么走的抑郁趨向。護士應該敏銳地意識到患者的情緒變化，對其動之以情、曉之以理，讓其比較生命與子宮誰更重要。同時，護士應該做好家屬的心理護理，要求他們協助醫(yī)護人員做好患者的心理支持。患者家屬對患者體現了無微不至的關懷，患者未出現心理問題。

3 討論

3.1 產后出血致子宮切除患者的心理特點及干預:由于患者年齡小，對手術的方法、安全程度及對手術的后果不了解，使其很容易產生恐懼的心理 。同時，有些患者會擔心術后不能再生育會導致夫妻感情的破裂。也有部分患者性格偏內向，對醫(yī)學知識有所了解，但并不完全準確，故思想負擔過重。因此，積極的心理干預就顯得尤為重要。術前，應做好患者的思想工作，解除手術的種種顧慮，積極給予安慰，消除患者緊張恐懼和不安的情緒。另外，患者家屬的情緒會直接影響患者的情緒，故不僅要讓家屬克制悲觀情緒，而且要指導他們對患者進行心理安慰，這是能穩(wěn)定患者的心理變化的重要環(huán)節(jié)。術后要實行保護性治療措施，以免患者過于緊張。對病情要給予科學的解釋，做好心理安慰和思想工作。

3.2 產后出血致子宮切除患者的護理:產后出血的預后隨失血量、失血速度及產婦體質不同而異。嚴密觀察病情，對產后出血致子宮切除的患者應準確計算其失血量，包括沙布、棉墊、手術單，引流瓶中的血液量等。同時，將貯血盆墊于產婦臀下以計算陰道失血量。密切觀察患者生命體征的變化，發(fā)現有心率加快，血壓下降，手足濕冷等休克前期的癥狀及時通知醫(yī)生，為醫(yī)師的診治提供第一手資料。由于患者存在出血多，創(chuàng)傷大、營養(yǎng)失調、貧血等情況，應給予飲食指導，以期患者盡快恢復體力。囑患者術后2個月內避免提舉重物，避免從事增加盆腔充血的活動。1個月內避免陰道沖洗和性生活，以免影響陰道殘端的愈合，引起感染。遵醫(yī)囑如期返院復查，若出現陰道出血，異常分泄物更應及時回院檢查。

參考文獻

第6篇

關鍵詞：心理護理干預;機械通氣;氣管插管

神經內科臨床常見很多病情極其危重的患者，這些患者病情發(fā)展快，危害性大，患者常伴有呼吸無力，精神萎靡，痰液粘黏不易咳出的臨床表現，臨床常應用機械通氣進行緩解患者的臨床癥狀，但是在實際應用中，進行長時間使用機械通氣的患者常會出現，舒適感降低，內心十分恐慌以及緊張焦慮的表現，在臨床上應用心理護理干預的方法對患者的治療有很大的促進作用[1]。本文選取我院自2012年1月~2013年6月，進行門診收治入院的患者病例，對所有患者進行心理護理干預，并于干預前后進行心理狀態(tài)的對比分析。

1資料與方法

1.1一般資料選取我院自2012年1月~2013年6月進行門診收治入院的患者病例90例，對所有患者進行心理護理干預。其中男47例，女43例，患者的年齡43~79歲，平均年齡是(38.4±11.3)歲，患者的機械通氣平均時間是(4.28±6.34)d,患者的性別、年齡和病因上的比較無統(tǒng)計學意義。

1.2方法臨床表現呼吸困難，痰多，粘稠的患者給予及時叩背、吸痰及其面罩吸氧的應用。

當患者氧分壓80mmhg時，出現中樞神經損傷、外周循環(huán)衰竭在呼吸機上潮氣量（VT）的設定標準是8~10ml/kg。呼吸頻率（RR）設置是12~18次/min，吸入氣氧濃度(FiO2)，常選用30%，對患者缺氧狀況的改善情況根據血氧分壓來進行調節(jié)；對于極危型的患者給予緊急采取氣管切開造口通氣，常選擇的位置在第3、4軟骨環(huán)，于頸部進行皮切開插管，將套管插入氣管，這樣患者能經套管進行呼吸。

1.3心理護理干預方式

1.3.1焦慮感的護理干預進行機械通氣的患者其情緒波動較大，人工氣道的建立給患者帶來極大的不適感對患者的影響很大，此時患者多存在情緒不安，焦慮、煩躁的思想，需要護理人與患者進行交談，給予患者關心與愛護，尊重和理解患者的心情。

1.3.2自卑感的護理干預在進行人工通氣的患者，大部分內心都會有著自卑的心理，護士應該對其心理狀況做出及的了解，讓患者明白機械通氣對她們的生活與生命并不會受到很大的干預與影響，盡量減輕和消除患者的自卑心理。

1.3.3恐慌感的護理干預很多進行造口術通氣的患者，他們都會存在恐慌的心理，因為自身呼吸功能受損，不能有效的進行自主呼吸，身體無力感和精神萎靡感讓他們有種即將走向死亡的恐懼感覺。護理人員應該針對患者在機械通氣后出現的恐慌感，進行有效的評估，并相對應的進行合理的解釋，減輕患者對身體治療的恐慌[2]。

1.3.4緊張感的護理干預進行氣管插管的患者，身旁總會有很多大小型的機器設備和導管的鏈接，呼吸機儀器上面的數字標注和警報燈的相應，同時還有醫(yī)護及時性的來回訪視和記錄，這不由自主的給患者帶來一種緊張的氣氛，他們認為這種環(huán)境是處于高度集中和壓抑的，導致患者產生高度煩躁、緊張心理。對于這樣情況下的患者，護理人員應該給與細心的觀察與呵護，防止患者因為環(huán)境和氣氛的原因，對治療情況產生影響。

1.4觀察指標在給予患者心理護理干預前后進行比較，觀察患者的臨床心理狀況，給予患者自行評估表的形式，進行評估其焦慮感、自卑感、恐慌感、緊張感的表現。

1.5統(tǒng)計學方法以SPSS18.0軟件包對數據進行統(tǒng)計分析。計量資料數據以(x±s)表示，以t進行檢驗。P＜0.05表示兩組間的差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

比較分析患者護理前后的心理狀況，在對患者進行有效的心理干預后， 給予患者自行評估表的形式，進行評價，結果顯示患者存在的心理狀態(tài)分別是,干預前:焦慮感33例(36.67%),自卑感21例(23.33%)，恐慌感19例(21.11%),緊張感 17例 (18.89% )；干預后：焦慮感3例(3.33%)，自卑感4例(4.44%)，恐慌感2例(2.22%)，緊張感2例 (2.22%)，心理護理干預后的患者的心理狀態(tài)明顯好于干預前，前后比較有顯著性差異(P

3討論

由于神內科機械通氣患者的特殊性，有效的心理護理干預模式顯得很重要，在操作過程中需要給予患者悉心的關照與呵護，給予患者的相關疾病的教育，理解和支持患者。給予患者及家屬講解關于通氣設置的作用和功能，告誡他們良好的心態(tài)對疾病的治療與康復有很好的促進作用，讓他們認識到心態(tài)對疾病預后的重要性[3]。

護理人員需要及時為患者排除心理焦慮與緊張，給予患者更多的心理安慰，與患者平易相處，走進他們內心，讓他們感覺醫(yī)護人員就是他們的知己，同時告訴患者家屬對患者要有耐心的態(tài)度與親切的關心，讓患者感受到家人對他們的愛。通過有效的心理護理干預模式，用開導和鼓勵的方式促進患者的康復，讓患者感覺到溫暖和自信，真正感受到自己的價值和意義，促進疾病的快速康復。

參考文獻:

[1]陳愛萍，蔡虻.ICU患者非計劃性拔管及相關研究進展[J].中華護理雜志，2007，42(10)：934-937.

第7篇

2003年11月－2005年9月，筆者應用柴蒲瀉心湯治療幽門螺桿菌(HP)相關性消化性潰瘍 65例，并與含質子泵抑制劑奧美拉唑的三聯療法作對照，取得良好療效，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 入選病例標準

年齡18～65歲，入選前2 d內鏡檢查證實有胃或十二指腸單一、多發(fā)復合性潰瘍，潰瘍直徑大于3 mm，潰瘍分期為活動期(A期)[1]，HP現癥感染(組織學、胃活檢尿素酶試驗)陽性。

1.2 排除病例標準

胃鏡證實非活動性潰瘍、活動性出血、幽門梗阻；病理證實胃潰瘍有可疑及惡變者；經實驗室、B超、X線、CT、心電圖等檢查有心、肺、肝、膽、胰、腎等嚴重器質性疾病者；治療前2個月應用西藥抑酸、抗HP及保護胃黏膜藥物治療者。

1.3 一般資料

所有病例均為本院住院患者，符合入選標準的病例共128例，隨機分為2組。治療組65例，男46例，女19例；年齡20～65歲，平均(41.3±11.5)歲；病程最長31年，最短6個月，平均(5.24±2.25)年；胃潰瘍20例，十二指腸潰瘍42例，胃、十二指腸復合性潰瘍3例。對照組63例，男44例，女19例；年齡18～65歲，平均(40.5±12.7)歲；病程最長32年，最短7個月，平均(4.95±2.14)年；胃潰瘍19例，十二指腸潰瘍41例，胃、十二指腸復合性潰瘍3例。2組年齡、性別、病程、潰瘍類型、主要癥狀(上腹痛、反酸、腹脹、噯氣、納差、惡心等)經統(tǒng)計學處理，差異無顯著性意義(P>0.05)。

1.4 治療方法

治療組用柴蒲瀉心湯：柴胡10 g，蒲公英30 g，黃芩10 g，黃連9 g，大黃10 g，延胡索10 g，丹參30 g，白及10 g，烏賊骨30 g，白芍10 g，黨參15 g，白術15 g，茯苓30 g，枳殼10 g，甘草6 g。水煎服，每日1劑，早晚各服1次，連服4周。對照組用含質子泵抑制劑奧美拉唑的三聯療法：奧美拉唑腸溶片(山東新時代藥業(yè)有限公司生產，批號050203)20 mg，口服，每日1次，連服4周；阿莫西林膠囊(哈藥集團三精明水藥業(yè)有限公司生產，批號0509219)1.0 g；甲硝唑片(山東博山制藥有限公司生產，批號010003)0.4 g，口服。均每日2次，連服1周。2組均以4周為1個療程。

1.5 觀察指標與方法

患者于治療前及療程結束4周后進行胃鏡檢查與HP檢測，并詳細記錄癥狀、體征變化情況，進行評分，評分標準見表1。在治療過程中，如患者出現腹痛、反酸等癥狀，隨時復查胃鏡。表1 胃腸道癥狀評分標準（略）

1.6 療效標準

1.6.1 臨床癥狀療效評定標準

顯效：臨床積分消失，或癥狀積分減少>75%；有效：臨床積分改善，或癥狀積分減少為50%～75%；無效：臨床癥狀無好轉或加重，或癥狀積分減少

1.6.2 潰瘍療效評定標準

依據中華人民共和國衛(wèi)生部藥政局1988年制定的療效評定標準評定[2]。愈合：潰瘍及周圍炎癥全部消失；顯效：潰瘍消失，仍有炎癥；有效：潰瘍面積縮小50%以上；無效：潰瘍面縮小不及50%。

1.6.3 HP根除標準

療程結束4周后復查組織學、快速尿素酶試驗，如兩項為陰性，則為根除，如1項或2項為陽性或弱陽性，則表示未根除。

1.7 統(tǒng)計學方法

計量資料用t檢驗；計數資料用χ2檢驗和Ridit分析。

2 結果

2.1 2組臨床癥狀療效比較

(見表2)表2 2組患者臨床癥狀療效比較[例(略)]注：2組比較，P>0.05。

2.2 2組治療前后主要癥狀積分比較

治療后2組在胃脘痛、返酸的改善方面與治療前比較，差異均有顯著性意義(P

2.3 2組潰瘍愈合情況

(見表4)表4 2組患者潰瘍病灶愈合情況比較[例(略)]注：2組各型潰瘍的愈合率及總有效率比較，P>0.05。

2.4 HP根除情況

治療組65例，HP根除55例(84.6%)；對照組63例，HP根除52例(82.5%)。2組比較差異無顯著性(P>0.05)。

2.5 不良反應

治療組未見任何不良反應，對照組有23例發(fā)生不良反應(36.5%)，其中惡心8例，頭暈3例，皮疹3例，便秘3例，口干2例，口中金屬味2例，谷丙轉氨酶輕度升高2例。

3 討論

HP是消化性潰瘍發(fā)生的最重要致病因子之一[3]。通過根治HP促使?jié)冇喜⒎乐箯桶l(fā)的嘗試越來越受到關注。含質子泵抑制劑如奧美拉唑的三聯療法是目前應用較多的根除HP有效方案之一，但由于其治療存在一定的不良反應，故治療依從性較差。近年來由于抗生素的廣泛使用，普遍存在HP耐藥菌株增多的問題，如對甲硝唑耐藥發(fā)生率美國為24%～70%，韓國為95%，中國部分地區(qū)為30%～60%，對克拉霉素耐藥率約為20%[4]。因此，進一步尋找對HP敏感的藥物已成為臨床迫切的任務。

消化性潰瘍屬于中醫(yī)“胃脘痛”范疇。中醫(yī)認為，脾胃內傷、脾失健運是本病發(fā)病的內因，外感六、內傷七情及飲食勞倦失調等是發(fā)病的外邪攻擊因素，內外因結合導致脾胃運化失司，升降失調，氣滯血瘀，濕熱蘊結，氣血不調，胃膜不生而發(fā)病。臨床上，HP相關性消化性潰瘍以脾胃濕熱型多見，其次為氣滯血瘀、脾胃虛弱型。柴蒲瀉心湯方中蒲公英甘苦寒，清熱化濕、解毒消癰；黃連、黃芩清熱化濕；延胡索、丹參活血化瘀、通絡止痛；白及、烏賊骨制酸斂瘍、去腐生肌、護膜止痛；柴胡、枳殼、白芍、甘草(四逆散)以疏肝理氣、理脾和胃；大黃消滿除脹、下瘀止痛；黨參、白術、茯苓益氣健脾滲濕，補中焦脾胃之氣，以使“正氣存內，邪不可干”。全方共奏清熱化濕、制酸止痛、理氣和血、健脾和胃之效。

現代研究表明，黃連、黃芩、延胡索、丹參、甘草等對HP有直接殺滅作用[5]；蒲公英對HP有抑殺作用，并對損傷的胃黏膜有保護作用；柴胡能調節(jié)下丘腦-植物神經功能，黨參可提高機體免疫功能[6]，二藥合用，通過調節(jié)神經免疫網絡扶正固本而消炎?，F代藥理研究結果表明，大黃中4種蒽醌化合物除大黃酚有止血作用外，其余均具有抗菌作用，且4種大黃蒽醌化合物皆對HP有較強的抑制生長作用。最近的研究又發(fā)現原先認為無抗菌作用的某些成分(如大黃酚)對HP的生長亦有抑制作用[7]。此外，大黃還對胃腸黏膜有明顯的保護作用，并能改善應激性胃腸黏膜病變的血流灌注[8]。因此，該方可能通過抑制胃酸分泌、抑殺HP、改善胃黏膜血流量、增強胃黏膜的屏障功能、促進潰瘍愈合來達到治療目的。

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第8篇

【摘要】 人工構建鎘鹽污染源，選用差速離心結合雙向凝膠電泳（2DPAGE）法，高效提取、分離和篩選牙鲆（Paralichthys olivaceus， PO）受鎘鹽脅迫后的肝臟全蛋白和差異蛋白質。實驗結果表明: 選用直接裂解法提取牙鲆肝（PO liver POL）全蛋白質且用2DPAGE分離，可獲得約800個蛋白斑點，其中鎘鹽誘導了11個差異蛋白斑點。以相對離心力為1000×g、12000×g和100000 ×g 的差速離心法，分別制備了3種沉淀蛋白和1種胞漿蛋白，稱為POL組分Ⅰ、POL組分Ⅱ、POL組分Ⅲ和POL組分Ⅳ（胞漿蛋白），蛋白斑點數目分別為380、550、500和850個，總計2280個，明顯高于直接裂解法。比較分析法發(fā)現，差速離心結合2DPAGE分離技術可獲得牙鲆肝臟受鎘鹽脅迫后表達的54個差異蛋白質，并適合于用肽質量指紋(peptide mass fingerprint，PMF)圖譜技術鑒定。本實驗所建立的差速離心結合蛋白質組學技術可高效提取、分離和鑒定組織全蛋白或差異蛋白，并能有效地篩選出蛋白指示物。

【關鍵詞】 牙鲆肝，蛋白質組學，差速離心，鎘污染，蛋白指示物

Abstract Both total proteome and differential proteins were effectively extracted， separated and selected by a combined approach of both differential centrifugation and 2DPAGE in liver of Paralichtys olivaceus( POL) under the stress of cadmium chloride as an artificial pollution source. Approximately 800 spots for extraction of whole protein separated with 2DPAGE were obtained by direct lysis in the POL. In addition， approximately 11 differential proteins in POL were also obtained under the stress of cadmium chloride. The differential centrifugal were used to prepare three sedimentation and a plasmolysis proteins， called POL component Ⅰ， POL component Ⅱ， POL component Ⅲ， and POL component Ⅳ(plasmolysis protein)， respectively. Total protein spots for each gel were calculated to have 380， 550， 500， and 850， respectively， approximately 2280 spots in sum， while total spots are much higher than those by direct lysis approach. Using the comparison method， approximately 54 differential proteins in POL were obtained by a combined technology of both differential and two dimensional polyacylaminde gel electrophoresis(2DPAGE) methods under the stress of cadmium chloride. In addition， these differential proteins can be further identified by peptide mass fingerprint(PMF). Here， these combined techniques can be effectively used to extract， separate and identify the whole proteins and the differential proteins including protein markers in the biological tissue.

Keywords Paralichthys olivaceus liver， proteomics， differential centrifugation， cadmium contamination， protein marker.

1 引 言

建立高效提取與分離動植物及微生物組織細胞中的全蛋白，且可鑒定蛋白質的方法，是目前開展蛋白質組學研究所面臨的技術難題之一[1，2]。雙向凝膠電泳（2DPAGE）和雙向液相色譜分離（2DLC）技術是目前開展蛋白質組學研究的常用分離技術，但前者易受細胞組織內干擾物影響，例如核酸、多糖和脂類物質[3]；而后者在分離過程中，易丟失部分蛋白質，難獲取全蛋白[4]。目前，組織細胞全蛋白的常用破碎技術有丙酮沉淀法、裂解法、凍溶法和酶解法等[1～4]。針對生物材料來源不同，優(yōu)化提取組織細胞全蛋白和減少內外干擾物是開展蛋白質組學必須克服的難題。至今，相關的研究已有大量且詳細的研究報道[5，6]，但尚未建立一套較為成熟、重復性高和廣譜性好的細胞組織全蛋白質提取方法。環(huán)境蛋白質組學是目前環(huán)境毒理學中最有挑戰(zhàn)性和前瞻性的領域之一，相關的研究僅僅處于起步階段。環(huán)境蛋白質組學能同時篩選與鑒定出由各類重金屬和有機污染物，在單一和聯合脅迫效應環(huán)境中所誘導的多種蛋白指示物[7，8]，為揭示復雜的毒理機理和評價危害性提供實驗證據[1，2，9]。

本實驗以牙鲆肝臟組織為材料，選用差速離心和雙向凝膠電泳非在線聯用技術，高效提取和優(yōu)化分離受鎘鹽脅迫前后的牙鲆肝臟全蛋白，為后續(xù)選用蛋白質組學技術篩選及鑒定監(jiān)測鎘污染程度及危害性的蛋白質標志物提供可信度較高的結果。

2 實驗部分

2.1 儀器、試劑與材料

雙向電泳儀(北京六一儀器廠)；REFLEX 型MALDITOF質譜儀（德國Bruker公司）；各類冷凍離心機（貝克曼公司）。載體兩性電解質（Amersham公司），pH 3～10；胰蛋白酶(Promega公司)；基質α氰4羥肉桂酸（美國ICN生物醫(yī)學公司）;碘乙酰胺(Sigma 公司)；丙稀酰胺、甲叉丙稀酰胺等試劑均購自上海生物工程技術有限公司；勻漿緩沖液：0.25 mol/L 蔗糖，1 mmol/L EDTA，50 mmol/L TrisHCl，1 mmol/L PMSF (pH=7.4)；樣品裂解液：7 mol/L 尿素，4% CHAPS，2 mol/L 硫脲，60 mmol/L DTT，10 mmol/L Tris，1 mmol/L EDTA，1 mmol/L PMSF，0.5% 載體兩性電解質，0.0002% 溴酚蘭。分裝，－20 ℃保存待用；雙向電泳和銀染方法中所需試劑均參考文獻[1，10]。

實驗所需的牙鲆均購于廈門人工養(yǎng)殖場。使用前，牙鲆需在實驗室馴養(yǎng)一周。實驗前72 h開始停止喂食，防止飼料中微量重金屬影響牙鲆的正常代謝。隨機選擇牙鲆10只，并隨機分為實驗組和對照組。實驗組牙鲆置于人工模擬構建的CdCl2（10 mg/L）的污染環(huán)境中，繼續(xù)飼養(yǎng)72 h。對照組牙鲆置于在人工海水中繼續(xù)飼養(yǎng)。實驗前，選用剪斷脊椎處死方式處理牙鲆，并迅速解剖，獲取牙鲆肝臟，用預冷的磷酸鹽緩沖液直接沖洗，并保存在－80 ℃以備使用。

2.2 差速離心提取牙鲆肝臟蛋白質

取實驗組（受鎘鹽脅迫）5條牙鲆的肝臟（POL）各20 g，混合后共100 g。對照組的POL取法同上。加入等體積勻漿緩沖液，在冰浴條件下研磨制成勻漿。隨后，以 400×g 的相對離心力離心10 min，去除未磨碎的組織和細胞，收集上清液Ⅰ，備用。選用下列差速離心技術，分步收集蛋白沉淀物，并選用2DPAGE進行有效分離，具體實驗步驟（始終維持在4 ℃環(huán)境下）：（1）1000×g 沉淀分離：以1000×g 的相對離心力離心上清液Ⅰ10 min，收集沉淀蛋白和上清液Ⅱ。該沉淀物主要是細胞核，用勻漿緩沖液洗滌兩次，最后收集沉淀樣品備用（－20 ℃保存，下同）；（2）12000×g 沉淀的分離：以12000×g的相對離心力離心上清液Ⅱ 30 min，收集沉淀蛋白和上清液Ⅲ。選用勻漿緩沖液洗滌該沉淀蛋白兩次，最后收集沉淀樣品備用；（3）100000×g 沉淀的分離: 以100000×g的相對離心力離心上清液Ⅲ 30 min，收集沉淀蛋白質和上清液Ⅳ。上清液Ⅳ中多數蛋白是胞漿蛋白，收集樣品，凍干備用；(4) 上述所有收集的蛋白組分分別充分溶解于裂解液中，并選用100000×g的相對離心力離心蛋白樣品 10 min，分別收集上清液，稱為POL蛋白組分Ⅰ（1000×g 沉淀蛋白）、POL蛋白組分Ⅱ（12000×g 沉淀蛋白）、POL蛋白組分Ⅲ (100000×g 沉淀蛋白)和POL蛋白組分Ⅳ（胞漿蛋白），并用于雙向電泳分離。

2.3 雙向凝膠電泳分離條件

2.3.1 等電聚焦電泳

在上樣之前，參考文獻[10]先進行預電泳。預電泳結束后，換上樣品液，在用Bradford法測定樣品液的總蛋白濃度后，以150 μg 總蛋白上樣，然后進行等電聚焦電泳。

2.3.2 凝膠電泳

按照SDS均一膠的配方配置11%膠濃度的凝膠。將平衡后的膠條轉移到SDS凝膠上，并在膠條上覆蓋一層含有溴酚蘭的0.5%瓊脂糖，在140 V的恒定電壓下進行電泳。待溴酚蘭前沿到達凝膠底端時，停止電泳。

2.4 銀染、圖像分析及蛋白鑒定

參照文獻[10]的銀染方法進行蛋白質染色。染色后，利用掃描儀對SDS凝膠板進行透射掃描。選用Melanie 4 Trial軟件進行凝膠電泳圖譜中的蛋白質總數和差異斑點分析與統(tǒng)計。用REFLEX 型MALDITOF質譜儀獲得各蛋白的肽質量指紋圖，采用反射模式、正離子譜測定。激光波長為337 nm，質譜信號單次掃描累加200次，用 BRUKER 肽混合物作外標。選用常規(guī)PMF和數據庫比對技術直接鑒定差異蛋白質[11] 。數據庫選擇MSDB，檢索基本條件參照文獻[10]。

3 結果與討論

3.1 直接裂解法POL全蛋白分離

圖1是牙鲆受金屬鎘脅迫后，采取直接裂解法提取POL全蛋白質的2DPAGE圖譜。從圖1可看出，實驗組和對照組的蛋白質斑點分布趨勢基本一致，具有較好的重現性。

采用Melanie 4 Trial軟件進行蛋白質斑點數目統(tǒng)計與分析，對照組和實驗組2DPAGE圖譜中的蛋白質斑點數目約為800個，其中多數蛋白質斑點的pI 范圍集中在 4.5～9.0之間，蛋白質亞基的分子量在25～100 kD之間，具有較高的分辨率，適合于后續(xù)蛋白質鑒定。

通過比對分析，可獲得11個差異蛋白質斑點，其中高表達蛋白2個（A6和A11）；上調蛋白6個（A1、A4、A7、A8、A9和A10）；下調蛋白3個（A2、A3和A5）。這些差異蛋白斑點均與受鎘鹽誘導有關，推測是牙鲆肝臟產生的應激蛋白質。

3.2 優(yōu)化建立差速離心法分離POL全蛋白質技術

肝臟是動物代謝的重要場所之一，具有各類復雜代謝途徑和含有豐富的蛋白質。借鑒文獻［12］，選用2DPAGE分離法可獲得約近千個鼠肝臟全蛋白斑點數的實驗結果。

本實驗選用直接裂解法提取POL全蛋白，但只獲取約800個蛋白斑點的2DPAGE圖譜。顯然，圖1中的全蛋白質斑點數偏少，不太適合進一步深入開展POL蛋白質組學研究，尤其不適合研究鎘鹽毒理學和篩選連續(xù)監(jiān)測流動水體鎘污染程度的蛋白指示物。在系列比對實驗基礎上，建立了差速離心法高效提取牙鲆肝臟全蛋白技術，具體實驗步驟見圖2。圖2顯示了選用差速離心法使牙鲆肝臟中不同沉降系數的蛋白質得到粗分離，減少高豐度蛋白的干擾和提高低豐度蛋白富集的效果，有助于開展牙鲆肝臟全蛋白組學研究和篩選差異蛋白質。

目前，常用于動物肝臟全蛋白質提取技術且適合于開展蛋白質組學研究方法有TCA/丙酮酸沉淀法、緩沖液法、裂解法及“鳥槍”蛋白質組分析法[13，14]等。但這些方法獲取肝臟全蛋白種類大都低于1500種，明顯少于本實驗建立的差速離心提取技術。

3.3 在鎘鹽脅迫下，牙鲆肝臟組分Ⅰ的差異蛋白

圖3是在鎘鹽脅迫下，牙鲆肝臟組分Ⅰ全蛋白和差異蛋白圖譜。采用Melanie 4 Trial軟件對圖解中的蛋白質斑點數目進行統(tǒng)計與分析，可在亞細胞組分Ⅰ中獲得約380個蛋白質斑點。比較圖3A（實驗組）和圖3B（對照組），可獲得11個差異蛋白斑點。其中A1、A2、A3、A4、A6、A7和A8為上調蛋白，而A5、A9、A10和A11為下調蛋白。

3.4 在鎘鹽脅迫下，牙鲆肝臟組分Ⅱ的差異蛋白

圖4是在鎘鹽脅迫下，牙鲆肝臟組分Ⅱ全蛋白和差異蛋白的2DPAGE圖譜。經統(tǒng)計與分析后，發(fā)現亞細胞組分Ⅱ中獲得約550個蛋白斑點。

比較圖4A（實驗組）和圖4B（對照組）蛋白斑點分布和差異特性，可獲得13個差異蛋白斑點，其中的A1和A4斑點為上調蛋白；A2、A3、A6、A7、A8、A9、A11和A12斑點為下調蛋白；A5、A10和A13為高表達蛋白（high expression proteins）。

3.5 在鎘鹽脅迫下，牙鲆肝臟組分Ⅲ的差異蛋白

圖5是在鎘鹽脅迫下，牙鲆肝臟組分Ⅲ的全蛋白和差異蛋白質的2DPAGE圖譜。經分析與統(tǒng)計，可獲悉圖5顯示出約500個蛋白斑點。比對圖5A和圖5B結果，可進一步獲悉兩圖之間約有14個差異蛋白斑點。其中的A10、A11和A14斑點為上調蛋白；A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8、A9、A12和A13斑點為下調蛋白。

3.6 在鎘鹽脅迫下，牙鲆肝臟組分Ⅳ的差異蛋白

通常認為，細胞破碎液經100000×g的相對離心力離心后所獲得的蛋白上清液視為細胞的胞漿蛋白。根據 3.2 節(jié)所描述的實驗步驟和離心率可獲悉，牙鲆肝臟組分Ⅳ屬于胞漿蛋白質。在鎘鹽脅迫下，所獲得牙鲆肝臟組分Ⅳ的差異蛋白質，視為金屬鎘脅迫牙鲆肝臟表達的差異胞漿蛋白。從圖6中可看出牙鲆肝臟組分Ⅳ含有約850個蛋白斑點，其胞漿蛋白質種類明顯高于其它牙鲆肝臟組分的蛋白質種類，說明了牙鲆肝臟含有豐富的胞漿蛋白質。比較圖6A和圖6B中的差異蛋白斑點分布情況和規(guī)律可獲悉， 在鎘鹽脅迫下，牙鲆肝臟表達了16種差異蛋白，其差異蛋白總數目多于其它POL組分。其中高表達的蛋白質為A1、A2、A4和A9；上調蛋白為A5、A6、A7、A10、A11和A14；下調蛋白為A3、A8、A12、A13、A15和A16。

進一步選用肽質量指紋（PMF）圖譜和數據庫比對技術對上述54個差異蛋白進行鑒定.結果發(fā)現，有3種同類差異蛋白，即共有51個不同的差異蛋白。在鑒定結果中發(fā)現了一些文獻[15，16]中已報道的與鎘鹽脅迫有關的蛋白（見表1）。表1 牙鲆肝臟中表達的與鎘鹽脅迫有關的差異蛋白的質譜鑒定（略）

總結圖3～6中所顯示的蛋白斑點數目可獲悉，選用差速離心法分離牙鲆肝臟的全蛋白種類約2280個，明顯高于直接裂解法（800個蛋白斑點）的結果。雖然選用不同離心力分離POL亞細胞蛋白組分之間含有同一類蛋白，但只發(fā)現存在少量同類蛋白質，說明了選用差速離心法所獲取的POL全蛋白中只含有少量的同類蛋白質，推測所獲得的蛋白種類應高于2000種，適合于開展POL蛋白質組學研究。在鎘鹽脅迫下，同樣也獲取54種差異蛋白，其中只有3種同類差異蛋白，即鎘鹽脅迫牙鲆肝臟表達了51種差異蛋白，這也適合于篩選潛在的可用于研究金屬鎘毒理學和監(jiān)測流動水體重金屬污染的蛋白質指示物。顯然，差速離心結合雙向電泳技術顯著提高了牙鲆肝全蛋白的分離效率和差異蛋白的檢出率。

由于動物組織、細胞及卵等中蛋白質種類間存在豐度差異[17]，現有的全蛋白提取與分離技術不易通過單一的2DPAGE方法同時顯示高低豐度不同的蛋白質。而本實驗所建立的差速離心技術結合蛋白質組學技術，不僅降低蛋白之間產生沉淀現象，而且還使許多低豐度蛋白得以富集和鑒定，從中獲取更多的蛋白種類。在蛋白的分離效率上明顯高于現有的全蛋白提取與分離技術，如直接裂解法，適合開展蛋白質組學研究和篩選與鑒定差異蛋白質組學。前人研究已發(fā)現，熱激蛋白質70S（HSP70）和過氧化氫酶均可作為監(jiān)測金屬鎘污染或氧化損傷的指示蛋白[15，16]。從表1所鑒定的差異蛋白質種類中也含有這兩種蛋白。此外， V型ATP酶和細胞骨架相關蛋白（例如：Bete 微管蛋白和actin）等均與鎘代謝和受鎘抑制表達有關。這說明，選用蛋白質組學及相關分析技術可篩選并鑒定許多潛在的適合作為蛋白質指示物且可用于開展鎘毒理學機理、污染程度的關鍵指示蛋白質[18～20]。

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