發(fā)布時(shí)間：2022-07-27 11:09:12
序言：寫作是分享個(gè)人見(jiàn)解和探索未知領(lǐng)域的橋梁，我們?yōu)槟x了8篇的基因工程疫苗樣本，期待這些樣本能夠?yàn)槟峁┴S富的參考和啟發(fā)，請(qǐng)盡情閱讀。
很多人在寫論文的時(shí)候不知道為什么要寫參考文獻(xiàn)，認(rèn)為論文的內(nèi)容才是最重要的，對(duì)參考文獻(xiàn)也不是特別重視，參考文獻(xiàn)的寫作對(duì)論文來(lái)說(shuō)是有很大的影響的，可以通過(guò)它來(lái)看出論文的學(xué)術(shù)研究?jī)r(jià)值。下面是千里馬小編收集的基因工程論文參考文獻(xiàn)，希望可以給大家?guī)?lái)幫助。
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摘 要：正在研制的口蹄疫新型疫苗有10多種，分別是納米微球黏膜免疫疫苗，表位肽疫苗、口蹄疫O型復(fù)合表位蛋白疫苗、A型重組毒株（Re-A/WH/2009）的口蹄疫O型、A型、亞洲Ⅰ型三價(jià)滅活疫苗、豬口蹄疫O型廣譜基因工程病毒滅活疫苗、口蹄疫O型標(biāo)記疫苗、豬O型Mya98毒株空衣殼疫苗、豬口蹄疫O型合成肽疫苗（多肽2600+2700+2800）、?？谔阋撸∣型、Asia1型）二價(jià)合成肽疫苗、以及口蹄疫病毒活載體疫苗。其中取得突破性進(jìn)展的有5種，?？谔阋撸∣型、Asia1型）二價(jià)合成肽疫苗PD50值大于6.0，免疫持續(xù)期為6個(gè)月，保存期為12個(gè)月，已完成所有實(shí)驗(yàn)室研究和臨床試驗(yàn)，申請(qǐng)了新獸藥注冊(cè)并已通過(guò)初審；豬口蹄疫O型合成肽疫苗（多肽2600+2700+2800）PD50值大于6.0，免疫持續(xù)期為6個(gè)月，保存期為12個(gè)月，已完成所有實(shí)驗(yàn)室研究和臨床試驗(yàn)，現(xiàn)已申請(qǐng)新獸藥注冊(cè)并通過(guò)復(fù)核試驗(yàn)和復(fù)審；含A型重組毒株（Re-A/WH/2009）的口蹄疫O型、A型、亞洲Ⅰ型三價(jià)滅活疫苗PD50值大于6.0，免疫持續(xù)期為6個(gè)月，保存期為12個(gè)月，獲得了農(nóng)業(yè)部新獸藥注冊(cè)證書，實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)業(yè)化；豬口蹄疫O型廣譜基因工程病毒滅活疫苗已申報(bào)農(nóng)業(yè)部臨床試驗(yàn)批文；口蹄疫O型標(biāo)記疫苗已完成疫苗質(zhì)量研究，并已申請(qǐng)新獸藥注冊(cè)。其他疫苗研究也均取得了程度不等的進(jìn)展。利用反向遺傳操作技術(shù)平臺(tái)，獲得基因工程修飾病毒疫苗株5株：（1）rV-STN-5；（2）9O/rV-1；（3）Re-A/WH/2009；（4）Re-Mya/98/BY/2010；（5）Re-Asia1/HN/2006。利用基因克隆、重組等技術(shù)，獲得其他基因工程修飾病毒9株，分別為：（1）表達(dá)O型FMDV不同亞型主要免疫原性基因的重組偽狂犬病毒1株；（2）共表達(dá)O-A-Asia1型FMDV主要免疫原性基因的重組偽狂犬病毒1株；（3）表達(dá)FMDV免疫原性基因的桿狀病毒2株；（4）表達(dá)豬源IFN-α/IFN-γ和A型FMDV P1基因的重組桿狀病毒3株；（5）表達(dá)口蹄疫和小反芻獸疫病毒主要保護(hù)性抗原基因的重組羊痘病毒2株。成功研制CpG-IFN、CpG-IL4以及多磷腈和CpG DNA等生物復(fù)合佐劑3種，納米乳油佐劑、納米粒IL-2佐劑以及多孔硅和上轉(zhuǎn)換熒光納米材料的載藥系統(tǒng)等納米復(fù)合佐劑材料4種，以及IL-2、IL-4和IFN-γ等多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒和多糖類免疫增強(qiáng)劑4種。
關(guān)鍵詞：口蹄疫 病毒 新型疫苗 基因工程修飾病毒疫苗株 免疫佐劑
Abstract：More than 10 kinds of the new type vaccines is developing. There are 5 kinds of the new vaccine made in major progress. The first one is bivalent synthetic peptide vaccine of FMD type O and type Asia1， the second one is synthetic peptide vaccine in pig of FMD type O（peptide 2600+2700+2800）， the third one is type A recombinant strains （Re-A/WH/2009） of type O、type A and type Asia1 trivalent inactivated vaccine， the fourth one is the marker vaccine of FMD type O， and the last one is broad-spectrum inactivated virus gene engineering vaccine in pig of FMD type O. The first four vaccines were all safe to the animals， PD50 values were greater than 6.0， the vaccine immune duration is 6 months， the shelf life of synthetic peptide vaccine is 12 months， and all has applied for a new veterinary drug registration. The first one has completed all laboratory studies and clinical trials， and has passed the preliminary examination for new veterinary drug application. The second one has completed all laboratory studies and clinical trials， and has passed the inspection test and review. The third one has got the new veterinary drugs registration certificate， and realized industrialization. The last one has applied clinical trial. Varying degrees of progress has been made in other vaccine research. With the reverse genetics technology platform， five genetically engineered vaccine candidate of FMDV were screened and constructed， which were rV-STN-5， O/rV-1， Re-A/WH/2009， Re-Mya/98/BY/2010 and Re-Asia1/HN/2006. Using gene cloning and recombination technology， other nine genetically engineered vaccine candidate of FMDV were constructed， respectively is：（1） PRV TK-/gE-/PanP12A-P1；（2） PRV TK-/gG-/OAY；（3） Two recombinant baculovirus which expressing the immunogenicity gene of FMDV；（4） Three recombinant baculoviruses which expressing interferons alpha/IFNCgamma of porcine and P1 gene of FMDV type A；（5） Two restructuring goatpox viruses which expressing the major protective antigen gene of FMDV and small ruminants virus. Three biological compound adjuvants containing CpG-IFN， CpG-IL4， multi-phosphonitrile and CpG DNA， four nano composite adjuvants including Nano EC adjuvant， nanoparticle adjuvant IL-2， and drug-loaded system of porous silicon and upconversion fluorescence nanomaterials， four mammalian cell expression plasmids which can expressing IL-2， IL-4 and IFN-γ as well as polysaccharides immunopotentiator have successfully developed.
Key Words：Foot and mouth disease virus；New type vaccine；Genetically engineered vaccine candidate；Immunologic adjuvant
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關(guān)鍵詞：螃蟹；病害防控；生物防治
1水產(chǎn)病害生物防治技術(shù)
這些年，國(guó)內(nèi)水產(chǎn)養(yǎng)殖規(guī)模擴(kuò)大。但是，一些病毒病、細(xì)菌病的感染，嚴(yán)重制約水產(chǎn)集約化發(fā)展。而抗生素藥物的濫用，導(dǎo)致這些致病菌源的耐藥性增強(qiáng)，以往的適用藥劑久治難愈。就此，迫切需要一種生態(tài)環(huán)保型的防病措施加以替代。為此，生物技術(shù)應(yīng)用而生，雖然還處于研發(fā)階段，但是很多技術(shù)上的優(yōu)勢(shì)，讓我們看到了降藥殘、抗耐藥性的曙光。用于水產(chǎn)病害防治的生物技術(shù)，主要是借助生物基因重組、反義核酸、反義核酶等技術(shù)而改變水產(chǎn)動(dòng)物的抗病性，以起到降低病害、提高產(chǎn)量、獲得高效益產(chǎn)出的目的。從生物防治的應(yīng)用效果來(lái)看，展現(xiàn)出這些技術(shù)優(yōu)勢(shì)：減少化學(xué)藥劑使用量，降低藥物殘留，節(jié)約生產(chǎn)成本。降低耐藥性，有效抑制致病菌源的擴(kuò)散蔓延。有利于生態(tài)環(huán)保，為消費(fèi)者提供綠色、無(wú)公害水產(chǎn)品。有利于保護(hù)生態(tài)環(huán)境，響應(yīng)構(gòu)建生態(tài)環(huán)保社會(huì)的響應(yīng)。
2螃蟹病害影響因素
不同其他水產(chǎn)養(yǎng)殖，螃蟹養(yǎng)殖要獲得高產(chǎn)高效，需要注意的事項(xiàng)更多。這些細(xì)節(jié)一旦疏忽，將會(huì)造成嚴(yán)重的病害威脅。
2.1水質(zhì)問(wèn)題
螃蟹生活在水中，對(duì)水質(zhì)的要求更高。尤其池塘中養(yǎng)蟹，水體必須做出處理，否則會(huì)為病害感染創(chuàng)造條件。其一，定期組織消毒。消毒常用漂白粉、生石灰，在殺滅致病菌的同時(shí)，能確保水體潔凈衛(wèi)生。其二，投放腐殖質(zhì)肥料。池塘中加適量腐殖質(zhì)，主要用作肥料。達(dá)到水體變青綠色，證實(shí)養(yǎng)分充足。
2.2生存環(huán)境
生存環(huán)境除水質(zhì)，還有居住和活動(dòng)場(chǎng)所。螃蟹營(yíng)養(yǎng)儲(chǔ)備源自水中，多數(shù)以水草為食源，泥沙僅僅能輔助消化。螃蟹一般居住在較為潮濕的環(huán)境內(nèi)，對(duì)于生長(zhǎng)環(huán)境的水質(zhì)有較高的要求，養(yǎng)殖螃蟹時(shí)應(yīng)對(duì)養(yǎng)殖環(huán)境的水質(zhì)做好清潔工作，布置適量較為茂盛的水草，使螃蟹能夠小范圍的活動(dòng)，并圍繞著產(chǎn)生很多昆蟲、小魚、小蝦等等，會(huì)使螃蟹的生存環(huán)境更加健康，生態(tài)系統(tǒng)更加完善，對(duì)避免各種病害效果不錯(cuò)。
3生物技術(shù)在螃蟹養(yǎng)殖病害防治上的應(yīng)用
3.1基因重組用于增強(qiáng)抗病性
以往螃蟹病害的防治，對(duì)消毒劑、抗菌素的依賴較大。此類藥物的頻繁使用，一方面影響水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境；另一方面造成病原微生物的耐藥性。為避免此類問(wèn)題的問(wèn)題，可嘗試借助病毒蛋白基因重組技術(shù)，加載到合適的載體中，而后注射到螃蟹常食用食物中，以增強(qiáng)其抗病體質(zhì)，確保螃蟹養(yǎng)殖的穩(wěn)定性和安全性。
3.2生物反義技術(shù)用于病毒病的控制
螃蟹養(yǎng)殖生產(chǎn)中，病毒病的危害較大，借助水平傳播和垂直傳播，能殃及整個(gè)螃蟹池。在病毒病的控制中，生物反義技術(shù)的作用顯著。該項(xiàng)技術(shù)的作用原理，利用反義核酸技術(shù)和反義核酶技術(shù)，對(duì)病毒原核細(xì)胞和真細(xì)胞進(jìn)行基因操作，以抑制病毒的合成和復(fù)制，有效控制螃蟹病毒病的傳播。作為一種新型的生物控病技術(shù)，其用于螃蟹病毒病的防控功效是不容置否的。但是，還需要不斷的完善，以擴(kuò)大病毒病防控的應(yīng)用范圍。
3.3轉(zhuǎn)基因用于增強(qiáng)免疫力
螃蟹養(yǎng)殖生產(chǎn)期間，在例行消毒、投藥預(yù)防等工作時(shí)，或多或少在水體中會(huì)形成藥物殘留，久之會(huì)造成機(jī)體的某些病理病變。出于病防重于治的考慮，可借助轉(zhuǎn)基因技術(shù)，提前在螃蟹體內(nèi)注射特定啟動(dòng)因子的外源基因，使著病毒反義RNA序列提前得以表達(dá)，這樣后期病毒內(nèi)侵后的復(fù)制將受阻，而起到控制病害的目的。自長(zhǎng)遠(yuǎn)角度考慮，該項(xiàng)技術(shù)對(duì)螃蟹養(yǎng)殖的病害防控是很有效的，但是當(dāng)前還沒(méi)有得到大面積的推廣應(yīng)用。
3.4基因工程苗用于預(yù)防接種
基因工程運(yùn)用在螃蟹養(yǎng)殖中防治病害能夠起到良好的作用，因?yàn)樗軌驇椭π放懦欢ǖ目陀^因素的影響，能夠讓水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)品中的螃蟹在生存環(huán)境中可以更好的成長(zhǎng)?；蚬こ桃呙绲某霈F(xiàn)，讓螃蟹養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)看到了更多的希望?；蚬こ桃呙鐝募?xì)菌和病原體中提取了具有一定免疫力的基因，然后進(jìn)行了基因重組，讓疫苗提高了免疫力，在與傳統(tǒng)疫苗的對(duì)比中，提高了抗藥性和穩(wěn)定性，能夠提高養(yǎng)殖螃蟹的免疫力，在提高了螃蟹免疫力的基礎(chǔ)上，能夠保證健康與天然?；蚬こ桃呙缒軌驖M足大部分水產(chǎn)養(yǎng)殖戶的需要，能夠發(fā)揮出其作用，并且在技術(shù)層面上趨于成熟，能夠批量生產(chǎn)，滿足市場(chǎng)的需要。
關(guān)鍵詞：植物葉綠體;基因工程;發(fā)展;應(yīng)用;存在問(wèn)題;展望
葉綠體作為植物中與光合作用直接相連的重要細(xì)胞器,其基因組的功能也因此扮演著十分重要的角色。1882年straburger觀察到藻類葉綠體能分裂并進(jìn)入子代細(xì)胞;1909年baur和correns通過(guò)在3種枝條顏色不同的紫茉莉間雜交得出,質(zhì)體是母本遺傳的。人們便開(kāi)始對(duì)葉綠體遺傳方面產(chǎn)生了濃厚的興趣[1]。1988年boynton等首次用野生型葉綠體dna轉(zhuǎn)化了單細(xì)胞生物衣藻突變體(atpb基因突變體),使其完全恢復(fù)光合作用能力,標(biāo)志著葉綠體基因工程的誕生[2]。葉綠體基因工程作為一種很具有發(fā)展前景的植物轉(zhuǎn)基因技術(shù),在植物新陳代謝、抗蟲性、抗病性、抗旱性、遺傳育種等方面都將有著越來(lái)越重要的意義。
1葉綠體基因工程概述
1.1葉綠體簡(jiǎn)介
葉綠體是植物進(jìn)行光合作用的重要器官,是一種半自主型的細(xì)胞器,能夠進(jìn)行自我復(fù)制,含有雙鏈環(huán)狀dna。葉綠體dna分子一般長(zhǎng)120~160kb。葉綠體dna有ira和irb 2個(gè)反向重復(fù)序列(分別位于a鏈和b鏈),兩者基因大小完全相同,只是方向相反,它們之間有1個(gè)大的單拷貝區(qū)(大小約80kb)和1個(gè)小的單拷貝區(qū)(大小約20kb)。
1.2葉綠體基因組轉(zhuǎn)化優(yōu)點(diǎn)
葉綠體基因具有分子量小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、便于遺傳的特點(diǎn),故相對(duì)于傳統(tǒng)的細(xì)胞核遺傳更能高效表達(dá)目的基因,這是因?yàn)槿~綠體基因本身?yè)碛芯薮蟮目截悢?shù)[3]。葉綠體基因可實(shí)現(xiàn)外源基因的定點(diǎn)整合,避免位置效應(yīng)和基因沉默;遺傳表達(dá)具有原核性;安全性好,葉綠體屬于母系遺傳,后代材料穩(wěn)定;目的基因產(chǎn)物對(duì)植物的影響小。利用葉綠體基因轉(zhuǎn)化的這些優(yōu)點(diǎn),可以加快育種速度和效率,節(jié)約育種時(shí)間。
1.3葉綠體轉(zhuǎn)化的主要過(guò)程
葉綠體轉(zhuǎn)化過(guò)程通常分4步:一是轉(zhuǎn)化載體攜帶外源目的基因通過(guò)基因槍法或其他轉(zhuǎn)化體系導(dǎo)入葉綠體;二是將外源表達(dá)框架整合到葉綠體的基因組里;三是篩選具有轉(zhuǎn)化的葉綠體細(xì)胞;四是繼代繁殖得到穩(wěn)定的葉綠體轉(zhuǎn)化植物[4]。
1.4葉綠體轉(zhuǎn)化的主要方法
依據(jù)葉綠體轉(zhuǎn)化的主要過(guò)程,生物學(xué)家相應(yīng)地研究若干種葉綠體基因轉(zhuǎn)化的方法,其中常用的葉綠體轉(zhuǎn)化方法:一是微彈轟擊法。將鎢粉包裹構(gòu)建完整的質(zhì)粒載體,用基因槍轟擊植物的各種組織、器官,然后對(duì)重組葉綠體進(jìn)行連續(xù)篩選,不斷提高同質(zhì)化水平,最后獲得所需的轉(zhuǎn)基因植株[5]。二是農(nóng)桿菌t-dna介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法。將外源目的基因、選擇標(biāo)記基因等構(gòu)建到農(nóng)桿菌的ti質(zhì)粒上,然后通過(guò)與植物組織或器官共培養(yǎng),最后把所需外源基因轉(zhuǎn)化到葉綠體并獲得表達(dá)。三是peg處理法。只需將構(gòu)建好的質(zhì)粒(含外源基因、標(biāo)記基因、同源片斷、啟動(dòng)子、終止子等)在一定的peg濃度下與植物原生質(zhì)體共培養(yǎng)。
2葉綠體基因工程的應(yīng)用
2.1提高植物光合效率
植物的光合效率非常有限,太陽(yáng)能的很小一部分可以轉(zhuǎn)化為植物所需要的能量,從而轉(zhuǎn)變?yōu)槿祟愋枰漠a(chǎn)品。植物光合效率取決于rubisco酶的豐富度。rubisco酶一方面可以制造可溶性蛋白,另一方面也可以限制co2合成。人們可以通過(guò)2種直接的方法提高光合速率:一是加速酶催化的循環(huán)過(guò)程;二是提高酶的特性,減少光呼吸浪費(fèi)的能量[6]。很多科學(xué)家正試圖通過(guò)提高rubisco酶來(lái)提高植物的光合效率,而其中擬南芥和水稻的定點(diǎn)整合試驗(yàn)取得了重大突破,證明葉綠體基因工程是生產(chǎn)高光合效率作物植物的最有價(jià)值的方法。
2.2合成有機(jī)物質(zhì)
由于葉綠體型轉(zhuǎn)基因植物具有環(huán)境安全性好、底物豐富、產(chǎn)物區(qū)域化等優(yōu)點(diǎn),已被越來(lái)越多的人關(guān)注,并成為工業(yè)化生產(chǎn)特定有機(jī)物質(zhì)的可靠場(chǎng)所。例如,有科學(xué)家已發(fā)明了用葉綠體基因工程表達(dá)聚3-羥基丁酸酯合成相關(guān)基因的方法。聚3-羥基丁酸酯及其他類型的聚3-羥基鏈烷酸酯同屬于聚酯類物質(zhì),是自然界中多種細(xì)菌的碳源及能源儲(chǔ)備物。具有生物可降解性,如取代化學(xué)合成塑料將能從源頭解決塑料廢棄物引起的“白色污染”。其通過(guò)構(gòu)建了含phbb、phm、phbc和aada基因表達(dá)盒的葉綠體整合及表達(dá)載體,通過(guò)基因槍轟擊法轉(zhuǎn)化煙草。northem點(diǎn)雜交、rt-pcr分析結(jié)果表明,葉綠體型轉(zhuǎn)基因植株中目的基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)明顯高于核轉(zhuǎn)化植株中相應(yīng)基因。
2.3生產(chǎn)疫苗
人類治療用蛋白質(zhì)可以在葉綠體中實(shí)現(xiàn)表達(dá),表達(dá)效率取決于外源基因的整合位點(diǎn),增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄和翻譯的調(diào)控元件以及外源蛋白的穩(wěn)定性等。人類已經(jīng)在用葉綠體基因生產(chǎn)疫苗方面開(kāi)展了卓有成效的工作。例如,范國(guó)昌等將甲型肝炎病毒vp3p1區(qū)和丙型肝炎病毒c區(qū)融合,并導(dǎo)入到衣藻葉綠體基因組中,融合蛋白得到高效表達(dá),且具有雙抗原活性。而霍亂病毒蛋白b(ctb)抗原ctb已經(jīng)在葉綠體中轉(zhuǎn)化成功,預(yù)示著轉(zhuǎn)基因植物疫苗的可商業(yè)化前景。tregoning等將tetc基因在煙草葉綠體基因組進(jìn)行表達(dá),為了增加mrna的穩(wěn)定性及在煙草葉片內(nèi)表達(dá)的可行性,他們將基因進(jìn)行了密碼子優(yōu)化,分別表達(dá)了未經(jīng)改造的富含at(72.3%at)和人工合成的富含gc(52.5%at)的基因,tetc-at和tetc-gc的表達(dá)量分別為總可溶蛋白的25%和10%。
2.4在植物抗性方面的研究
在抗蟲性方面,kota和cosa分別于1999年、2001年將btcryzaaz基因轉(zhuǎn)入煙草葉綠體,前者可100%殺死4 000多倍抗性的抗性蟲,后者報(bào)道bt表達(dá)量達(dá)46.1%。在抗逆性方面,人們通過(guò)編碼sod、apx等酶的基因已經(jīng)轉(zhuǎn)入到煙草、苜蓿、馬鈴薯、棉花的葉綠體中,提高了植物的耐氧化能力,從而提高了植物對(duì)環(huán)境脅迫的耐受能力。
2.5葉綠體基因組在系統(tǒng)發(fā)育學(xué)上的應(yīng)用
葉綠體在系統(tǒng)發(fā)育學(xué)上的優(yōu)點(diǎn):一是葉綠體基因組是僅次于核基因組的第二大基因組,為比較研究提供了一個(gè)較大的數(shù)據(jù)基礎(chǔ);二是葉綠體dna的核酸置換率適中,在應(yīng)用上很有價(jià)值。然而,用葉綠體dna研究系統(tǒng)發(fā)育也存在著明顯的不足:一是葉綠體基因組是母性遺傳的,因此并不能單靠葉綠體基因組來(lái)解釋居群間的雜交現(xiàn)象;二是雖然有越來(lái)越多的葉綠體dna被用作分子標(biāo)記來(lái)研究類群間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系,但只有將這些分子片段提供的信息與其他的分子片段信息、傳統(tǒng)的形態(tài)及生理特征結(jié)合起來(lái)獲得更多的信息,才能更接近系統(tǒng)發(fā)育的本來(lái)面目。
2.6葉綠體基因在消除環(huán)境憂慮問(wèn)題上的前景
當(dāng)今最為普遍的問(wèn)題就是外源基因從轉(zhuǎn)基因作物到雜草的逃逸,這一逃逸主要是通過(guò)花粉的擴(kuò)散,產(chǎn)生超級(jí)雜草或產(chǎn)生和其他作物之間的基因污染,對(duì)環(huán)境極為不利。葉綠體基因工程產(chǎn)生的基因逃逸現(xiàn)象的風(fēng)險(xiǎn)遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于核轉(zhuǎn)化作物,因?yàn)榇蠖鄶?shù)作物中的質(zhì)體dna都是母系遺傳,這樣就可以避免作物和作物、作物和雜草之間的雜交,消除人們對(duì)基因污染的憂慮。
3葉綠體基因工程存在的問(wèn)題
3.1葉綠體基因轉(zhuǎn)化在雜合體上的穩(wěn)定性問(wèn)題
由于高等植物的每個(gè)細(xì)胞中有10~100個(gè)葉綠體,每個(gè)葉綠體內(nèi)有10~100個(gè)葉綠體基因組拷貝,因此轉(zhuǎn)化的葉綠體和未轉(zhuǎn)化的野生型葉綠體同時(shí)存在于轉(zhuǎn)基因植株中,造成這種雜合體在遺傳上是不穩(wěn)定的。在轉(zhuǎn)化外源基因之前,目前可采用降低葉綠體拷貝數(shù)、高壓篩選和選用致死突變體作為外源基因的受體等方法使轉(zhuǎn)基因植株易于同質(zhì)化。
3.2植物的種類有待擴(kuò)展
可能是由于大多數(shù)植物的葉綠體基因組序列不清楚,因此無(wú)法確定用于載體構(gòu)建的同源重組片段和外源基因的插入位點(diǎn)。目前,已成功轉(zhuǎn)化的植物種類很少,只有番茄和煙草通過(guò)有性生殖使外源基因獲得穩(wěn)定遺傳,而番茄卻是唯一能有高的外源蛋白積累的可食用果實(shí)的植物。
4展望
雖然在葉綠體基因工程領(lǐng)域人們已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展,但對(duì)于改變?nèi)~綠體基因工程中所存在的缺點(diǎn),科學(xué)界仍然要有大量的工作需要進(jìn)行。為此,尋找更多更加合適的方法來(lái)改進(jìn)葉綠體基因工程,使其優(yōu)點(diǎn)更加明顯,必將在未來(lái)生物技術(shù)領(lǐng)域帶來(lái)又一場(chǎng)革命,為人類造福。
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【關(guān)鍵詞】 K88；LTB；表達(dá)
腸毒素大腸桿菌是引起世界上發(fā)展中國(guó)家嬰幼兒及到這些國(guó)家旅游者腹瀉的主要致病菌，危害嚴(yán)重?，F(xiàn)已知大腸桿菌定居因子和腸毒素與疾病密切相關(guān)，定居因子是大腸桿菌細(xì)胞表面菌毛，腸毒素是大腸桿菌產(chǎn)生的毒性分泌蛋白，有不耐熱腸毒素和耐熱腸毒素兩種。當(dāng)病原菌感染宿主后，大腸桿菌首先通過(guò)定居因子粘附到小腸粘膜上皮細(xì)胞刷狀緣受體上，抵抗住腸道蠕動(dòng)與腸內(nèi)分泌物清洗，維持ETEC在腸道內(nèi)生長(zhǎng)繁殖。然后釋放出腸毒素，與小腸細(xì)胞膜上的特異受體結(jié)合，引發(fā)細(xì)胞內(nèi)水、電解質(zhì)失衡，造成細(xì)胞吸收障礙，產(chǎn)生水樣、脫水性腹瀉。定居因子與小腸粘膜粘附和腸毒素致毒是大腸桿菌腹瀉不可或缺的兩個(gè)必要條件。
我們?cè)谇叭搜芯抗ぷ骰A(chǔ)上，構(gòu)建了一種能表達(dá)大腸桿菌pQE30-K88-LTB融合蛋白的基因工程菌株，并計(jì)劃把它轉(zhuǎn)化到乳酸菌中進(jìn)行表達(dá)，研制大腸桿菌基因工程活疫苗，利用乳酸菌作為載體，經(jīng)口服途徑進(jìn)入胃腸道，將大腸桿菌基因表達(dá)在活乳酸菌的表面，刺激機(jī)體的胃腸道產(chǎn)生粘膜免疫和體液免疫，以期達(dá)到增加疫苗的安全性，提高疫苗免疫效果，為更有效地預(yù)防嬰幼兒和旅行者腹瀉，提供一種新型基因工程菌苗的候選菌株。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 菌株與質(zhì)粒模板菌株和感受態(tài)細(xì)胞BL21、表達(dá)載體pQE-30，由本實(shí)驗(yàn)室保存；克隆載體pMD18-T, 購(gòu)自大連寶生物工程有限公司。
1.1.2 主要試劑、酶類限制性內(nèi)切酶和其它工具酶為MBI公司產(chǎn)品； 弗氏完全(或不完全) 佐劑、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體為Sigma公司產(chǎn)品；其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。
1.1.3 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)已發(fā)表的K88和LTB基因設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，序列如下：
K88-上游引物：GGATCCTTTGGTAATGTATTGAATG
K88-下游引物：GGTACCTTACTCTTTGAATCTGTC
LTB-上游引物：GGTACCCTCCCCAGACTATTACAGAACTAT
LTB-下游引物：AAGCTTGTTTTTCATACTGATTGCCGC
1.1.4 測(cè)序DNA序列由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)定。
1.2 方法
1.2.1 PCR 擴(kuò)增
1.2.1.1 DNA模板的制備 用移液器無(wú)菌取少量大腸桿菌接種到5ml液體LB培養(yǎng)基中，過(guò)夜培養(yǎng)后，采用煮沸法制備模板DNA。
1.2.1.2 K88和LTB基因的PCR擴(kuò)增 PCR反應(yīng)體系為1μLDNA模板、2μLdNTP、2.5μL PCR緩沖液、上下游引物各1μL、Taq酶0.25μL，混和后加水至總量為25μL；反應(yīng)的循環(huán)參數(shù)為94℃預(yù)變性10min；94℃變性1min；56℃退火1min；72℃延伸1 min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72℃繼續(xù)延伸10min。
1.2.2 pQE30-K88-LTB表達(dá)載體的構(gòu)建質(zhì)粒的提取和純化、酶切反應(yīng)、DN段的分離純化、連接、質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、菌株誘導(dǎo)表達(dá)等，參見(jiàn)分子克隆實(shí)驗(yàn)指南的方法。
1.2.3 蛋白電泳分析參見(jiàn)分子克隆實(shí)驗(yàn)指南。
1.2.4 重組pQE30-K88菌毛蛋白的純化 純化過(guò)程按照Qiagen蛋白質(zhì)純化試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。
1.2.5 重組蛋白抗血清的制備將含有純化重組蛋白的緩沖液與弗氏完全(或不完全) 佐劑按照11充分混勻乳化好后, 按照100μg/kg抗原的劑量免疫新西蘭大白兔。首次免疫2周后, 隔周加強(qiáng)免疫。末次免疫后一周, 頸動(dòng)脈放血, 于4℃冰箱保存, 析出的透明、淡黃色上清液即為K88-LTB融合蛋白的抗血清。
1.2.6 蛋白質(zhì)印跡分析 分別以K88、LTB單因子血清和自制的重組K88-LTB融合蛋白抗血清作第一抗體, 按1300 稀釋；羊抗鼠抗體作第二抗體,按15 000 稀釋使用。
2 結(jié)果
2.1 K88ac基因的擴(kuò)增結(jié)果
圖1: K88、LTB基因PCR擴(kuò)增結(jié)果
1.3 DNA Marker DL2000; 2. K88基因的PCR產(chǎn)物;
4. LTB基因的PCR產(chǎn)物
2.3 重組K88-LTB 融合蛋白基因的表達(dá) 將鑒定正確重組質(zhì)粒pQE30-K88-LTB導(dǎo)入到宿主菌中，誘導(dǎo)處理后, 進(jìn)行SDS-PAGE分析。結(jié)果表明(圖2)，重組K88菌毛蛋白亞基基因獲得高效表達(dá)。
圖2 SDS-PAGE電泳結(jié)果
1. 加IPTG誘導(dǎo)3h的重組菌;
2. 加IPTG誘導(dǎo)6h的重組菌;
3. 空載體; 4. 蛋白 Marker
2.4重組K88-LTB菌毛蛋白抗血清的免疫學(xué)檢測(cè)自制的融合蛋白抗血清和K88、LTB單因子血清做一抗分別對(duì)重組工程菌株的總蛋白進(jìn)行蛋白印記檢測(cè)。結(jié)果表明(圖3),均能檢測(cè)到大小約
為31kDa的陽(yáng)性反應(yīng)條帶。
圖3 融合蛋白的蛋白印記結(jié)果
1,6.蛋白Marker; 2. 陰性血清對(duì)照; 3. K88單因子血清為一抗的蛋白印記結(jié)果;
4. 重組菌抗血清為一抗的蛋白印記結(jié)果; 5.LTB單因子血清為一抗的蛋白印記結(jié)果
關(guān)鍵詞：雞柔嫩艾美耳球蟲；疫苗；基因重組苗
中圖分類號(hào)： S859.797 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A 文章編號(hào)： 1674-0432（2013）-08-82-2
雞球蟲病是由屬于頂復(fù)門、孢子蟲綱、真球蟲目、艾美耳科、艾美耳屬的原蟲寄生于雞腸道引起的疾病，由于其造成雛雞大量死亡，耐過(guò)的雞只因?yàn)橄δ苷系K，飼料轉(zhuǎn)化率下降，生長(zhǎng)發(fā)育緩慢而出現(xiàn)生產(chǎn)性能下降問(wèn)題，給養(yǎng)雞業(yè)造成巨大損失。感染雞的球蟲主要有柔嫩艾美耳球蟲（E.tenella），堆型艾美耳球蟲（E.acervulina），早熟艾美耳球蟲（E.praecox），巨型艾美耳球蟲（E.maxima），布氏艾美耳球蟲（E.brunetti），毒害艾美耳球蟲（E.necatrix）以及和緩艾美耳球蟲（E.mitis）[1]。其中，柔嫩艾美耳球蟲蟲株是該屬球蟲中毒力最強(qiáng)、危害性最大的蟲種，并且與其他球蟲株之間幾乎無(wú)交叉反應(yīng)，給養(yǎng)雞業(yè)帶來(lái)極大的危害，據(jù)Allen報(bào)道全世界每年因此病造成經(jīng)濟(jì)損失超過(guò)80億[2]。
1 重組表達(dá)亞單位疫苗
基因重組表達(dá)亞單位疫苗是利用DNA重組技術(shù)，將編碼E.tenella保護(hù)性抗原基因?qū)胧荏w細(xì)菌或者細(xì)胞，使其在受體中高效表達(dá)，分泌保護(hù)性抗原肽鏈，然后提取保護(hù)性抗原肽鏈，加入佐劑即成?；蛑亟M表達(dá)亞單位疫苗的候選基因有5401、SO7、3-1E、 MZ5-7和表面抗原SAG5、SAG10、SAG13、SAG 14等。
H. D. Danforth[3]等于1989年開(kāi)啟了對(duì)雞球蟲基因重組表達(dá)亞單位疫苗的篇章，他們把柔嫩艾美耳球蟲子孢子表面抗原5401導(dǎo)入到大腸桿菌中與β-galactosidase 融合表達(dá)，添加弗氏完全佐劑配制疫苗，經(jīng)該重組疫苗皮下免疫一次的雞在攻毒后的損害評(píng)分明顯低于對(duì)照組，增重效率則明顯高于對(duì)照組。Du Aifang [4]等，使用編碼艾美耳球蟲5401抗原轉(zhuǎn)入到致弱沙門氏菌中制備的重組疫苗，試驗(yàn)表明最多有55%的保護(hù)力。
SO7是位于子孢子折光體上的一種抗原。M. S. Crane[5]等的研究發(fā)現(xiàn)重組表達(dá)的E. tenella SO7抗原免疫雞只，不但能保護(hù)受到同源株攻毒的雞，同樣也能保護(hù)受到E. acervulina， E. maxima 和 E. necatrix攻毒的雞。Christian Klotz[6]等， 用SO7抗原與兩種不同的真核表達(dá)載體構(gòu)成的重組疫苗，做免疫保護(hù)性試驗(yàn)，均能夠減少排卵量，具有部分保護(hù)力，而且對(duì)其他球蟲也有一定的交叉保護(hù)，說(shuō)明SO7抗原可以作為候選疫苗。
麥博等[7]將E.tenella表面抗原SAG10做原核表達(dá)后將重組蛋白以lOOug/只肌肉注射免疫雛雞，攻蟲后觀察免疫效果，免疫組抗球蟲指數(shù)為152.13。說(shuō)明重組表達(dá)的EtSAGl0可誘導(dǎo)雛雞產(chǎn)生一定的抗球蟲免疫保護(hù)。E.tenella表面抗原SAG13和SAG14[8]，SAG2和SAG7[9] SAG5[10]做原核表達(dá)，將可溶性蛋白免疫雛雞，攻毒后檢測(cè)其重組蛋白的免疫保護(hù)效果，結(jié)果表明，這些重組表達(dá)蛋白均有一定的抗球蟲保護(hù)力。
Millter[11]等于1989年用抗Etenella子抱子28KD的單抗Mabl209從cDNA文庫(kù)中篩選出GX3262基因，表達(dá)的融合蛋白分子量為115kDa，試驗(yàn)表明用該重組抗原免疫幼齡肉雞對(duì)感染艾美耳球蟲卵囊產(chǎn)生明顯的部分保護(hù)作用。
B. M. Subramanian[12]等的研究發(fā)現(xiàn)一個(gè)來(lái)自于E. tenella 微線體的能激發(fā)宿主雞的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)的抗原EtMIC1，重組表達(dá)的EtMIC1能提供受試雞部分的免疫保護(hù)。
Ralf.Hosse[13]等首次克隆表達(dá)出柔嫩艾美耳球蟲的89kDa親環(huán)蛋白 EtCTP89，在E.tenella整個(gè)生活史中表達(dá)，其從CsA到Cyps具有緊密聯(lián)系，研究表明親環(huán)蛋白A具有抗球蟲作用。Nishinaka S[14]等從母系的無(wú)胸苷激酶活性的R27H1和 R27H4與雞的B細(xì)胞系MuH1 和MuH4融合制備單克隆抗體，研究表明能產(chǎn)生IgG。Clarke Lorraine E等克隆EtHL6抗原，該抗原能在Eimeria tenella的子孢子和第二代裂殖子階段表達(dá)，結(jié)果表明具有一定的保護(hù)作用。
2 重組DNA疫苗
重組DNA疫苗是將一種或者幾種抗原基因重組到表達(dá)載體，直接或經(jīng)包裝注入體內(nèi)表達(dá)出相應(yīng)抗原，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答。
X. Ding [15]等用E. tenella微線體抗原基因EtMIC-2構(gòu)建的DNA疫苗載體進(jìn)行卵內(nèi)雞胚免疫，結(jié)果表明其能提高雛雞攻毒后10天和17天的抗體水平，同時(shí)排卵量下降，增重提高。
3-lE是E.tenella子抱子與裂殖生殖階段的表面抗原，氨基酸序列全長(zhǎng)1086bp，含有一個(gè)由170個(gè)氨基酸組成的開(kāi)放閱讀框架。Song [16]克隆3-lE基因構(gòu)建 pMPI3-3-lE重組質(zhì)粒 ，插入到pBK-CMV載體中 ，以不同的免疫劑量和免疫方式免疫1日齡雛雞 ，14日齡時(shí)功毒， 10d后，檢測(cè)機(jī)體的抗體，結(jié)果表明不管何種接種方式 ，均能檢測(cè)到最高的循環(huán)抗體水平。說(shuō)明3-lE基因能夠促進(jìn)機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫保護(hù)作用。D. Ma [17]用共表達(dá)3-1E和IL-15的DNA疫苗載體免疫試驗(yàn)雞的結(jié)果表明其免疫保護(hù)效果（用ACI評(píng)價(jià)）比僅表達(dá)3-1E抗原的DNA疫苗的保護(hù)效果更好。Geriletu [18]用共表達(dá)E.tenella抗原基因MZ5-7和IL-17的DNA疫苗載體免疫試驗(yàn)雞，7天后雞脾細(xì)胞的IL-2和IFN-γ表達(dá)量上升，攻毒后免疫組的抗球蟲指數(shù)也明顯高于對(duì)照組，而且共表達(dá)IL-17的DNA疫苗比僅表達(dá)MZ5-7抗原的DNA疫苗的保護(hù)效果更好。徐守振[19]增出有3-l E抗原基因和雞IFN基因融合克隆到真核表達(dá)載體 proVAX中構(gòu)建雙價(jià)融合表達(dá)質(zhì)粒 proIE。將proIE于14、21日齡免疫AA肉雞，28日齡觀察免疫保護(hù)效果。結(jié)果顯示， proIE雙價(jià)融合DNA疫苗具有增強(qiáng)免疫保護(hù)作用，可顯著降低糞便中的卵囊排出量（P
TA4 是柔嫩艾美耳球蟲通過(guò)二硫鍵連接5kDa和17kDa兩條多膚形成的子孢子的一種表面糖蛋白。S. Q. Wu[20]的研究發(fā)現(xiàn)表達(dá)E.tenella抗原基因TA4的DNA疫苗pcDNA3.1-TA4和pcDNA3.1-Et1A-TA4經(jīng)肌肉免疫能提供試驗(yàn)雞部分免疫保護(hù)效果，抗球蟲指數(shù)（ACI）達(dá)到160。Xu Qianming [21]用嵌合有艾美耳球蟲TA4和IL-2基因的聯(lián)合表達(dá)疫苗誘導(dǎo)雞體對(duì)球蟲病的免疫力，結(jié)果表明TA4基因是有效的疫苗表達(dá)抗原，該抗原和細(xì)胞因子聯(lián)合表達(dá)能增強(qiáng)DNA疫苗的免疫力，是一個(gè)不錯(cuò)的方法。
λMZ5-7是在第二代裂殖子階段表達(dá)的一種分泌性蛋白（MZP）。秦睿玲[22]將λMZ5-7連接到pVAX載體構(gòu)建重組質(zhì)粒pVAX-Mzp5-7，用該重組質(zhì)粒肌肉注射機(jī)體內(nèi)表達(dá)，免疫試驗(yàn)表明該質(zhì)粒對(duì)雞柔嫩艾美球蟲的攻擊有較好的免疫保護(hù)作用。
L Yang [23]克隆廣東株Eimeria tenella的子孢子折光體抗原Etp28基因與AcMNPV-OCC（-））構(gòu)建重組表達(dá)體GST-6xHis-Etp28免疫雞只，實(shí)驗(yàn)表明具有部分保護(hù)作用，可以作為候選疫苗。Yang Guilian [24]，用重組雞痘病毒表達(dá)艾美耳球蟲菱形基因能夠誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，證明有部分保護(hù)作用。D.G..J. Breed[25]， 篩選出4段不同的基因片段用于免疫雞只，都能誘導(dǎo)出強(qiáng)烈的T細(xì)胞反應(yīng)，其中有一段分子量是26到30kDa的基因片段，試驗(yàn)表明能夠極大的減少盲腸病變。Alireza Talebi[26]，用編碼抗原的基因合成多肽疫苗用于預(yù)防雞只，分別用Eimeria acervulina 和Eimeria tenella 功毒，結(jié)果是能產(chǎn)生很高水平的抗體，細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)具有部分交叉免疫保護(hù)作用。
3 展望
從80年代開(kāi)始研究雞球蟲基因工程疫苗至今，取得了很大的成果。艾美耳球蟲重組疫苗研究表明以這些抗原基因制備的亞單位疫苗和DNA疫苗對(duì)雞球蟲攻毒具有一定的免疫保護(hù)作用，但所有這些研究中的重組疫苗都還達(dá)不理想的保護(hù)效果，離臨床應(yīng)用還有較大距離。艾美爾球蟲的基因工程重組疫苗研究之所以至今未有突破性進(jìn)展，我們分析主要有三方面的原因：其一，目前對(duì)艾美爾球蟲重組疫苗的研究大都是基于偶然發(fā)現(xiàn)的一些單個(gè)抗原基因進(jìn)行的一些試驗(yàn)性免疫效果研究，缺乏對(duì)艾美耳球蟲所有抗原的系統(tǒng)化研究基礎(chǔ)。其二，由于球蟲的生活史比較復(fù)雜，球蟲發(fā)育的每一階段都具有免疫原性，對(duì)球蟲感染誘發(fā)保護(hù)性免疫起關(guān)鍵作用的可能不只一種抗原，可能需要多種抗原的共同作用才能誘發(fā)保護(hù)性免疫反應(yīng)。其三，對(duì)球蟲感染宿主的機(jī)制現(xiàn)在仍然不清楚，這也是制約柔嫩艾美耳球蟲疫苗研究的一大難題。隨著分子生物技術(shù)的不斷發(fā)展和對(duì)球蟲基因的研究不斷深入，最終能研究出高效的基因重組疫苗。
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1限制酶的作用及影響因素
1.1 作用：切割特定的核苷酸序列
[高考賞析]（2008，全國(guó)I）已知某種限制性內(nèi)切酶在一線性DNA分子上有3個(gè)酶切位點(diǎn)，如圖中箭頭所指，如果該線性DNA分子在3個(gè)酶切位點(diǎn)上都被該酶切斷，則會(huì)產(chǎn)生a、b、c、d四種不同長(zhǎng)度的DN段?，F(xiàn)在多個(gè)上述線性DNA分子，若在每個(gè)DNA分子上至少有1個(gè)酶切位點(diǎn)被該酶切斷，則從理論上講，經(jīng)該酶切后，這些線性DNA分子最多能產(chǎn)生長(zhǎng)度不同的DN段種類數(shù)是（ ）
A.3 B.4 C.9 D. 12
【答案】C
【解析】：每一種限制性內(nèi)切酶切割DNA后會(huì)留下特征性的粘性末端，同時(shí)一次切割后，會(huì)把DNA分割成兩個(gè)片段，且不同的內(nèi)切酶切后的片段不一樣。若在3個(gè)酶切點(diǎn)切斷，得到4種長(zhǎng)度不同的DN段；若在2個(gè)酶切點(diǎn)切斷，得到3種長(zhǎng)度不同的DN段；若在1個(gè)酶切點(diǎn)切斷，得到2種長(zhǎng)度不同的DN段。因此最多能產(chǎn)生4+3+2=9種長(zhǎng)度不同的DNA分子。
1.2 作用結(jié)果：形成DN段末端
黏性末端：錯(cuò)位切，切下后的兩端形成一種回文式的單鏈末端。
平末端：平切，在兩條鏈的特定序列的相同部位切割，形成一個(gè)無(wú)黏性末端的平口。
[高考賞析]（2008，江蘇）將動(dòng)物致病菌的抗原基因?qū)腭R鈴薯制成植物疫苗，飼喂轉(zhuǎn)基因馬鈴薯可使動(dòng)物獲得免疫力。以下是與植物疫苗制備過(guò)程相關(guān)的圖和表。
請(qǐng)根據(jù)以下圖表回答下列問(wèn)題。
（1）在采用常規(guī)PCR方法擴(kuò)增目的基因的過(guò)程中，使用的DNA聚合酶不同于一般生物體內(nèi)的DNA聚合酶，其最主要的特點(diǎn)是 。
（2）PCR過(guò)程中退火（復(fù)性）溫度必須根據(jù)引物的堿基數(shù)量和種類來(lái)設(shè)定。表1為根據(jù)模板設(shè)計(jì)的兩對(duì)引物序列，圖2為引物對(duì)與模板結(jié)合示意圖。請(qǐng)判斷哪一對(duì)引物可采用較高的退火溫度？__________。
（3）圖1步驟③所用的DNA連接酶對(duì)所連接的DNA兩端堿基序列是否有專一性要求？ 。
（4）為將外源基因轉(zhuǎn)入馬鈴薯，圖1步驟⑥轉(zhuǎn)基因所用的細(xì)菌B通常為 。
（5）對(duì)符合設(shè)計(jì)要求的重組質(zhì)粒T進(jìn)行酶切，。假設(shè)所用的酶均可將識(shí)別位點(diǎn)完全切開(kāi)，請(qǐng)根據(jù)圖1中標(biāo)示的酶切位點(diǎn)和表2所列的識(shí)別序列，對(duì)以下酶切結(jié)果作出判斷。
①采用EcoRⅠ和PstⅠ酶切，得到_________種DN斷。
②采用EcoRⅠ和SmaⅠ酶切，得到_________種DN斷。
【答案】（1）耐高溫 （2）引物對(duì)B （3）否 （4）農(nóng)桿菌 （5）①2 ②1
【解析】：由圖1―①過(guò)程知，用EcoRI酶和AluI酶切割抗原基因DN段會(huì)得到XY片段，由圖1―②過(guò)程可知，用EcoRI酶和SmaI酶切割質(zhì)粒產(chǎn)生MN片段。這樣形成的兩個(gè)DN段用DNA連接酶形成重組質(zhì)粒。其中X、M連接處是EcoRI酶切割位點(diǎn)，M、N之間還有一個(gè)PstI酶切割位點(diǎn)。如果用EcoRI酶和PstI酶切割重組質(zhì)粒，將會(huì)在兩個(gè)切割位點(diǎn)切割產(chǎn)生2種DN段。但若用EcoRI酶切割重組質(zhì)粒，由于只有一個(gè)切割位點(diǎn)，所以只產(chǎn)生一個(gè)DN段。
[高考賞析]（2005、天津理綜II 31）限制性內(nèi)切酶Ⅰ的識(shí)別序列和切點(diǎn)是―GGATCC―，限制性內(nèi)切酶Ⅱ的識(shí)別序列和切點(diǎn)是―GATC―。在質(zhì)粒上有酶Ⅰ的一個(gè)切點(diǎn)，在目的基因的兩側(cè)各有1個(gè)酶Ⅱ的切點(diǎn)。
①請(qǐng)畫出質(zhì)粒被限制酶Ⅰ切割后所形成的黏性末端。
②請(qǐng)畫出目的基因兩側(cè)被限制酶Ⅱ切割后所形成的黏性末端。
③在DNA連接酶的作用下，上述兩種不同限制酶切割后形成的黏性末端能否連接起來(lái)？為什么？
【答案】：
①
②
③、可以連接。因?yàn)橛蓛煞N限制性內(nèi)切酶切割后形成的黏性末端是相同的。
【解析】：基因工程中往往用相同的限制性內(nèi)切酶切割目的基因和運(yùn)載體，但不同的限制性內(nèi)切酶所切割出的黏性末端是相同的，也是可以互補(bǔ)配對(duì)的。因此，基因工程中有時(shí)也采用不同的限制性內(nèi)切酶切割目的基因和運(yùn)載體。
1.3 作用實(shí)質(zhì)：使特定部位的兩核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開(kāi)。
1.4 影響因素：限制酶是一類酶，因此其活性受溫度、pH等因素的影響。
[高考賞析]（2007、全國(guó)II）下列有關(guān)基因工程中限制性內(nèi)切酶的描述，錯(cuò)誤的是（ ）
A、一種限制性內(nèi)切酶只能識(shí)別一種特定的脫氧核苷酸序列
B、限制性內(nèi)切酶的活性受溫度影響
C、限制性內(nèi)切酶能識(shí)別和切割RNA
D、限制性內(nèi)切酶可以從原核生物中提取
【答案】：C。
【解析】：由以上分析可知限制性內(nèi)切酶能識(shí)別和切割DNA。
2 限制性內(nèi)切酶的特異性
限制性內(nèi)切酶的特異性是指一種限制性內(nèi)切酶只能識(shí)別一種特定的核苷酸序列，并且在特定的切點(diǎn)上切割。一種酶識(shí)別切割部位一般具有反向重復(fù)序列，即在切割部位一條鏈正向讀的堿基順序與另一條鏈反向讀的順序完全一致。
3 限制性內(nèi)切酶與其它酶的比較
酶的種類 作用
限制性內(nèi)切酶（限制酶） 將DNA分子的脫氧核苷酸鏈的磷酸二酯鍵切開(kāi)
DNA聚合酶 按模板有要求將單個(gè)脫氧核苷酸連接形成DNA的子鏈，在DNA復(fù)制時(shí)起作用
DNA連接酶 兩個(gè)DN段之間形成磷酸二酯鍵，縫合斷口
關(guān)鍵詞：生物技術(shù)；制藥；應(yīng)用
生物技術(shù)也可以稱作是生物工程。以現(xiàn)在化的生命科學(xué)為主要基礎(chǔ)，綜合各種科學(xué)技術(shù)，科學(xué)原理以及先進(jìn)的科學(xué)手段，按照設(shè)計(jì)對(duì)生物體和生物原料的加工為人類生產(chǎn)出具有重要作用的生物技術(shù)產(chǎn)品。生物技術(shù)是人們對(duì)動(dòng)植物以及微生物本身的物質(zhì)加工而成，為人們生產(chǎn)數(shù)優(yōu)質(zhì)的生物技術(shù)產(chǎn)品更好的為社會(huì)服務(wù)?，F(xiàn)代生物制藥技術(shù)其中包括現(xiàn)代化生物技術(shù)和發(fā)酵技術(shù)，生物技術(shù)來(lái)源于相關(guān)的學(xué)科和生物學(xué)發(fā)展相融合的產(chǎn)物，其中以重組DNA技術(shù)為核心主要的基因工程，這之中還包括有生化工程、細(xì)胞工程、微生物工程和生物制藥等各個(gè)領(lǐng)域。生物技術(shù)是綜合許多種現(xiàn)代科學(xué)理論與生命科學(xué)研究出來(lái)的一種高新技術(shù)，運(yùn)用先進(jìn)的技術(shù)手段為我國(guó)制藥行業(yè)的研究創(chuàng)造出廣闊的應(yīng)用前景。
1 發(fā)酵工程制藥
現(xiàn)代的發(fā)酵制藥工程。又可以被稱作微生物工程，是指采用現(xiàn)代的生物技術(shù)手段，利用微生物的特定功能，為人類生產(chǎn)出有用的產(chǎn)品，工業(yè)生產(chǎn)的過(guò)程直接運(yùn)用微生物技術(shù)。微生物代謝生產(chǎn)的生物技術(shù)就是發(fā)酵工程制藥。發(fā)酵工程制藥中含有，抗生素、激素、維生素等相關(guān)的生理活性物質(zhì)。主要的研究對(duì)微生物改良和篩選，工藝研究，等處理產(chǎn)品后續(xù)的問(wèn)題。如今DNA重組技術(shù)對(duì)微生物菌類的改良有著重要的作用。在20世紀(jì)70年代中，基因技術(shù)和細(xì)胞技術(shù)融合等生物技術(shù)的不斷發(fā)展，發(fā)酵工業(yè)進(jìn)入了現(xiàn)代化的工程階段，其中生產(chǎn)的產(chǎn)品有酒精類飲料，還有胰島素、生長(zhǎng)激素和抗生素等多種保健藥物。發(fā)酵工程制藥利用微生物生長(zhǎng)以及代謝制作中藥，此類制作中藥方式比一般方式都優(yōu)越，可以全面的改善藥性，降低副作用，櫓幸钚猿煞痔峁┬碌姆⒄狗較潁產(chǎn)生新的藥物作用，針對(duì)各種適應(yīng)癥的治療，充分保護(hù)中藥成分，避免中藥活性成分遭到破壞，從而做到節(jié)約藥物資源。
2 基因工程制藥
基因工程制藥是指分子水平上基因的操作，根據(jù)人類的需求所設(shè)計(jì)的，按照設(shè)計(jì)方案創(chuàng)建含有新性狀的生物新品系，并且能使生物新品系穩(wěn)定的遺傳給下一代?；蚬こ膛c工程設(shè)計(jì)運(yùn)用了相似的方法，具有明顯的理學(xué)與工程學(xué)的特點(diǎn)。工程制藥通過(guò)DNA技術(shù)將疾病的蛋白質(zhì)、酶、核酸等基因藥物轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)和繁殖，最終可以獲得相應(yīng)的治療藥物。抗生素通常是人體的活性因子，主要研究基因的鑒定、克隆導(dǎo)體的構(gòu)建，導(dǎo)入產(chǎn)物分離純化等問(wèn)題?；蚬こ瘫蝗藗冋莆諘r(shí)間并不是很長(zhǎng)，但已經(jīng)多次的取得了實(shí)際性的成果和應(yīng)用價(jià)值，基因技術(shù)已經(jīng)成為我國(guó)的核心技術(shù)，將在制藥方面充分的發(fā)揮重要作用。
3 細(xì)胞工程制藥
相關(guān)于細(xì)胞工程制藥的范圍還沒(méi)有確切的說(shuō)法，細(xì)胞工程是根據(jù)分子生物學(xué)原理，應(yīng)用了細(xì)胞培育技術(shù)以及細(xì)胞水平進(jìn)行遺傳操作。細(xì)胞工程大體可分為細(xì)胞質(zhì)工程和染色體工程。細(xì)胞工程的主要關(guān)鍵是運(yùn)用植物和動(dòng)物的細(xì)胞培養(yǎng)作為藥物生產(chǎn)技術(shù)。利用細(xì)胞技術(shù)對(duì)動(dòng)植物的培養(yǎng)可以生產(chǎn)出人類活性因子，以及單克隆等抗體產(chǎn)品。也可以生產(chǎn)出活性因子疫苗等DNA產(chǎn)品。在地理?xiàng)l件和氣候環(huán)境的影響下植物細(xì)胞代謝產(chǎn)物含量仍然很高。系統(tǒng)正在研究培養(yǎng)，人參、三七等制藥用的植物，并對(duì)相關(guān)的培養(yǎng)條件做出了。分析表明，人參細(xì)胞培養(yǎng)物與藥理活性都和普通種植的人參沒(méi)有明顯差異。對(duì)于某些植物的細(xì)胞培養(yǎng)與生產(chǎn)已經(jīng)達(dá)到了商業(yè)化作用。除了對(duì)細(xì)胞大規(guī)模的培養(yǎng)之外，毛狀根與不定根的培養(yǎng)也很成功。黃氏毛狀根的培養(yǎng)效果與價(jià)格與藥物黃氏相似，希臘毛地黃細(xì)胞應(yīng)在褐藻酸欲的固定情況下培養(yǎng)，可將有毒的毛地黃物質(zhì)轉(zhuǎn)化成地高辛，運(yùn)用紫草細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)紫草寧等根據(jù)野生新疆雪蓮的抗炎等作用，相關(guān)人員等進(jìn)行了細(xì)胞培養(yǎng)物與天然新疆雪蓮抗炎、鎮(zhèn)痛的藥理實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)表明新疆雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物，可以成為野生雪蓮的替代品。資源短缺也是比較嚴(yán)重的問(wèn)題，對(duì)于資源短缺完全可以利用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)對(duì)犀角等相關(guān)藥用動(dòng)物器官進(jìn)行培養(yǎng)，此方式就能解決資源短缺的問(wèn)題。
4 酶工程制藥
酶工程指的是用酶、細(xì)胞，等擁有獨(dú)特的催化功能，借助生物技術(shù)手段為人類制造出需要的產(chǎn)品。酶學(xué)理論與化工技術(shù)結(jié)合形成的新技術(shù)就是沒(méi)酶工程?，F(xiàn)如今已經(jīng)有很多國(guó)家都運(yùn)用了固定化的酶和細(xì)胞生產(chǎn)藥品。沒(méi)工程技術(shù)是現(xiàn)代生物技術(shù)的重要部分，固定化酶不僅能合成藥物分子。還能用于對(duì)藥物的轉(zhuǎn)化。我國(guó)運(yùn)用微生物的兩部轉(zhuǎn)化方法成功的生產(chǎn)出維生素C，酶工程主要研究產(chǎn)藥酶，酶細(xì)胞固定化相關(guān)的操作條件等。酶工程的應(yīng)用前景一片光明，發(fā)酵工業(yè)與化學(xué)合成工業(yè)發(fā)生了巨大的改變。藥用植物的有效成分來(lái)源于植物的次生代謝產(chǎn)物?，F(xiàn)如今已有很多個(gè)國(guó)家充分的應(yīng)用固定化細(xì)胞與固定化酶進(jìn)行藥物的生產(chǎn)。
5 結(jié)束語(yǔ)
綜上所述，我國(guó)的生物技術(shù)已經(jīng)越來(lái)越重要，目前生物制藥的研究成果數(shù)量日益增長(zhǎng)，其技術(shù)制藥研究已經(jīng)不斷的深入各個(gè)領(lǐng)域，中藥研制新藥的環(huán)節(jié)也在不斷的介入在新藥研發(fā)中生物技術(shù)制藥形式相對(duì)比較重要，使生物技術(shù)制藥成為了研發(fā)主流。生物技術(shù)同時(shí)還具有對(duì)珍稀傳統(tǒng)藥材的保護(hù)同時(shí)還能生產(chǎn)出大量的高品質(zhì)藥材和藥品活性成分，使藥品活性成分的含量有效的提高。合理的應(yīng)用現(xiàn)代化生物技術(shù)，使我國(guó)的制藥行業(yè)不斷地取得更大的發(fā)展。
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