發(fā)布時間：2023-07-19 17:12:01
序言：寫作是分享個人見解和探索未知領域的橋梁，我們?yōu)槟x了8篇的基因治療的基本策略樣本，期待這些樣本能夠為您提供豐富的參考和啟發(fā)，請盡情閱讀。
1基因治療的途徑和常用載體
基因治療技術(shù)，一種新的治療策略在口腔再生醫(yī)學領域中的應用發(fā)展迅速?；蛑委熗ǔ２捎脙煞N途徑，體外間接基因治療(ex vivo)和體內(nèi)直接基因治療(in vivo) [3,6]。無論間接還是直接基因轉(zhuǎn)移都需要借助載體才能將外源基因轉(zhuǎn)入靶細胞內(nèi)。目前載體系統(tǒng)主要分為病毒和非病毒兩種[3]，常用的病毒載體有腺病毒（AV），腺相關病毒（AAV），逆轉(zhuǎn)錄病毒（RV，包括慢病毒載體），單純皰疹病毒（HSV），雜合病毒等[7-9]。非病毒性載體有裸DNA、脂質(zhì)體與脂質(zhì)體復合物、納米顆粒等[3]。
2基因治療在口腔再生醫(yī)學中的應用
2.1 頜面骨組織再生：用于治療頜骨缺損的靶基因很多，作用機制和環(huán)節(jié)不盡相同，目前的研究主要集中于骨形成蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)基因。Park等[10]應用脂質(zhì)體和腺病毒載體分別將BMP-2基因?qū)氪笫蠊撬杌|(zhì)細胞(BMSC，bone marrow stromal cells)，比較了兩種載體的體外、體內(nèi)成骨能力。體外實驗結(jié)果顯示腺病毒組的轉(zhuǎn)染效率是脂質(zhì)體組的兩倍。當將基因修飾細胞復合明膠海綿植入大鼠下頜骨的骨缺損區(qū)，BMP-2可以在體內(nèi)表達2 周以上，促進了下頜骨骨缺損的修復，其中腺病毒組4周后骨缺損幾乎完全愈合，而脂質(zhì)體組相對新骨形成速度較慢，6周后骨缺損基本愈合，陰性對照組8周時仍未見骨愈合。Zhao等[11]用腺病毒介導的BMP-2轉(zhuǎn)染BMSC細胞，結(jié)合磷酸三鈣支架材料可以修復下頜骨的缺損，獲得礦化密度較高的新生骨。Chang等[12]應用腺病毒載體攜帶BMP-2，體外修飾BMSC，并植入小型豬的上頜骨缺損區(qū)，實驗組的骨缺損在3個月后完全修復，組織學觀察顯示新生骨為成熟的編織骨且鈣化良好。近期，Ke等[8]應用安全性較好的AAV病毒載體介導BMP-2體外修飾BMSC，并將其植入兔子的上頜骨缺損，頜骨缺損的修復能力顯著提高。Ashinoff等[13]研究通過腺病毒介導的BMP-2 對大鼠下頜骨牽張成骨的影響。實驗結(jié)果表明，實驗組在牽張成骨部位新骨形成量顯著增加。
BMP基因治療在促進頜骨組織再生中的應用非常廣泛，近來也有一些研究報道了其他治療基因的應用，例如堿性成纖維生長因子（basic fibroblast growth factor， bFGF），音波刺猬因子（sonic hedgehog，SHH）等。Jiang等[14]將腺病毒介導的bFGF基因修飾的骨髓基質(zhì)干細胞移植入兔子下頜骨牽張成骨區(qū)域，可以有效地促進更多的新骨形成。Edward等[15]將逆轉(zhuǎn)錄病毒介導的Shh修飾的三種細胞(牙齦纖維細胞、間充質(zhì)干細胞、脂肪來源細胞)復合I型膠原植入兔的顱骨缺損處，6周后通過X線片、組織學觀察，骨組織缺損區(qū)域幾乎完全修復，同時機體沒有出現(xiàn)任何不良反應。
頜骨的生長調(diào)控需要多因子的協(xié)同作用，多個治療基因的聯(lián)合應用也取得了一定進展。Koh等[16]的研究證實通過基因治療的同時表達兩種成骨因子BMP2和BMP7，表現(xiàn)出了更強的骨組織再生能力。通過X線片，Micro CT和組織學切片進行檢測，4周后 BMP2和BMP7的聯(lián)合基因轉(zhuǎn)染組，其成骨能力顯著高于單個基因轉(zhuǎn)染組，表現(xiàn)為顱骨缺損區(qū)域幾乎完全修復，甚至個別缺損區(qū)的成骨量更致密，顯著高于陰性對照組。另外，將促血管生成因子與成骨因子聯(lián)合應用，可以更好地協(xié)同促進頜骨組織再生。Peng等[17]的研究表明單獨應用VEGF并不能促進骨的再生，但是將VEGF和BMP4基因共同修飾MDSC，并與明膠海綿共同植入小鼠的顱骨缺損區(qū)域后，血管新生和新骨形成能力顯著增強。
2.2 顳下頜關節(jié)組織再生：顳下頜關節(jié)的組織工程需要促進功能性骨和軟骨組織再生，并需要建立適當?shù)墓?軟骨交界區(qū)。 Schek等[18-19]將分化的豬軟骨細胞和Ad.BMP7基因修飾的人牙齦纖維細胞復合到生物支架中，并將復合物移植到免疫缺陷小鼠的皮下，4周后構(gòu)建了一種骨-軟骨組織，包括血管化骨，成熟的軟骨以及清晰的礦化界面。另一項研究進展是將基因直接導入下頜髁突，1999年，Kuboki等[20]用腺病毒載體攜帶B-半乳糖苷酶基因直接體內(nèi)法注射到豚鼠顳下頜關節(jié)上腔，4周后發(fā)現(xiàn)，關節(jié)軟骨表面和滑膜均有B-半乳糖苷酶的穩(wěn)定表達，從而證明了腺病毒介導基因治療顳下頜關節(jié)疾病的可行性。Rabie等[21] 用AAV病毒載體介導了治療基因VEGF感染了大鼠的髁突組織，體內(nèi)試驗證明VEGF的表達增強，促進了下頜髁突的軟骨內(nèi)成骨進程。Li等[22]用AAV病毒載體攜帶Vastatin基因，局部注射到顳下頜關節(jié)后區(qū)，進一步證明轉(zhuǎn)基因不僅表達在髁突軟骨，而且在關節(jié)盤和關節(jié)窩都有持續(xù)的表達。這些研究為生理性骨-軟骨結(jié)構(gòu)的構(gòu)建以及TMJ局部基因治療的應用前景提供了實驗依據(jù)。
2.3 牙周組織再生：牙周病造成牙周支持組織破壞及牙周附著喪失，是導致牙齒缺失的最主要原因。牙周病治療的目的不僅在于控制炎癥，更在于使已經(jīng)破壞的牙周組織再生以形成新附著。牙周組織再生包括因炎癥破壞吸收的硬組織(牙槽骨與牙骨質(zhì))和軟組織(牙周膜與牙齦)。Jin等[23]將攜帶血小板衍生生長因子-B（plateletderived growth factor-B，PDGF-B）的腺病毒直接注射于牙周缺損處，結(jié)果顯示，病毒感染組牙槽骨的修復4倍于對照組，而牙骨質(zhì)的修復則6倍于對照組，提示應用PDGF- B 基因治療可以促進牙周的修復潛能。Chang等[24]的進一步研究證實在牙周骨缺損處直接局部注射腺病毒介導的PDGF-B 是安全可靠的，沒有發(fā)現(xiàn)治療引起的機體不良反應。盡管2周內(nèi)在缺損局部可以檢測到病毒載體的DNA, 隨著時間的推移病毒載體的量逐漸衰減?？梢奝DGF-B基因轉(zhuǎn)染可有效地促進細胞增殖和缺損的充填，證實了基因轉(zhuǎn)入牙周細胞可以為牙周再生提供一個便捷的途徑。
2.4 牙體組織再生：牙再生的研究是口腔再生醫(yī)學研究中最為活躍的領域。Rutherford等[25]采用了體外間接基因轉(zhuǎn)染方式，將攜帶BMP-7的腺病毒載體感染培養(yǎng)的成體纖維細胞，然后將修飾后的細胞與膠原復合植入白鼬炎性牙髓組織中，研究發(fā)現(xiàn)BMP-7的基因轉(zhuǎn)染促進了修復性牙本質(zhì)的形成。Nakashima等[26-27]用電穿孔（Electroporation）的方法將分化因子（Gdf1）轉(zhuǎn)染到培養(yǎng)的小鼠牙髓細胞中可以在體外促進其向成牙本質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化。Nakashima等[28]又用超聲波的方法轉(zhuǎn)染Gdf1，發(fā)現(xiàn)它還可以促進犬的自體牙髓干細胞分化為成牙本質(zhì)細胞，同時在犬的模型上修復性牙本質(zhì)的形成增加，其中管狀牙本質(zhì)的再生最為明顯?？梢?，通過轉(zhuǎn)染特異性基因和生長因子進入成體牙細胞，為促進組織工程牙的形態(tài)發(fā)生提供了新的思路。
3基因治療的前景展望
成功的基因治療必須包括選擇適當?shù)闹委熁?、適當?shù)霓D(zhuǎn)導，使其在體內(nèi)獲得安全、持續(xù)和可調(diào)控的表達?？谇辉偕t(yī)學領域的基因治療，雖然在動物試驗上取得了一些初步經(jīng)驗，但是離真正的臨床推廣應用還有相當長的一段距離。將來的研究將著眼于以下幾個方面：①對于目的基因，仍需進一步明確何種基因或多種基因的聯(lián)合應用；②選擇與構(gòu)建一個安全、高效、可調(diào)控的甚至是具有組織特異性的靶向基因載體仍是基因治療面臨的重要問題；③在基因轉(zhuǎn)導方法上仍需決定最佳基因載體或者靶細胞的數(shù)量、最佳轉(zhuǎn)入體內(nèi)的時機，以及減少不良反應以達到最佳治療效果。隨著現(xiàn)代分子生物技術(shù)日趨成熟和基因工程研究的深入，相信這些問題在不遠的將來都會得到解決。
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RNA干擾（RNA interference，RNAi）是由內(nèi)源性或外源性雙鏈RNA（double stranded RNA，dsRNA）所誘發(fā)，高度特異性降解細胞內(nèi)同源mRNA，使基因沉默的現(xiàn)象。這種現(xiàn)象發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平，故又稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默（posttranscriptional gene silencing，PTGS）［1］。RNAi是生物體在進化過程中抵御病毒入侵，抑制由轉(zhuǎn)座子移動或重復序列的積累引起的基因組不穩(wěn)定的保護機制，另外還是基因表達調(diào)控的一條重要途徑。小干涉RNA（small interfering RNA，siRNA）是指干涉RNAi過程中在細胞內(nèi)產(chǎn)生的長約21～23核苷酸（nt）的小雙鏈RNA分子，是RNAi發(fā)揮功能的重要中間效能分子。RNAi自從1998年發(fā)現(xiàn)以來，就以其獨特的優(yōu)勢在功能基因組學研究中迅速占有一席之地，迄今已成為基因研究中不可或缺的工具之一，并且隨著對其作用機制的逐步了解和應用技術(shù)的日漸成熟，已開始應用于疾病防治等多個方面。本文就其機制，主要特征，以及在消化系腫瘤中的研究作一簡單綜述。
1 作用機制及主要特征
1.1 作用機制
RNAi在哺乳動物細胞中有兩種作用機制：一種是大于30 nt的長雙鏈RNA（dsRNA）產(chǎn)生的廣泛的、非特異性效應。其機制可能是激活了細胞內(nèi)的蛋白激酶R和RNA酶L，從而導致了非特異性的細胞凋亡。另一種是21～23 nt的短雙鏈RNA（siRNA）產(chǎn)生的相對具體的、特異性效應。目前，RNAi在抗病毒及腫瘤中的研究主要集中在siRNA產(chǎn)生的特異性效應，故下面主要介紹siRNA的作用機制。
siRNA的作用機制目前尚未完全闡明，但已基本達成共識，即①dsRNA在細胞內(nèi)與DICER酶（一種RNAaseIII家族異性識別dsRNA的酶）結(jié)合，隨即被分割成21～23個核苷酸的短鏈dsRNA，在這個過程中需要ATP的參與。②分割下來的短鏈dsRNA即為siRNA，它是RNAi的起始誘導物，與DICER酶形成RNA引導的沉默復合體（RISC），此時RISC無活性，隨后，siRNA經(jīng)歷一個依賴ATP的解雙鏈過程激活RISC［2］。③siRNA特異性地識別靶基因轉(zhuǎn)錄的mRNA，并引導RISC結(jié)合mRNA，RISC中的DICER酶將mRNA切割成21～23個核苷酸片段，此后mRNA被逐步降解，導致不能進行翻譯過程，從而引起目的基因沉默，抑制靶基因的表達。④新產(chǎn)生的dsRNA（siRNA）可繼續(xù)形成RISC復合物進入新一輪RNAi的循環(huán)，產(chǎn)生正反饋效應。這一過程需在RNA依賴RNA聚合酶（RdRP）的條件下進行。除上述機制外，轉(zhuǎn)基因真核生物dsRNA 還可引起相應基因的甲基化，促使異常RNA產(chǎn)生，最終導致基因沉默［3，4］。
1.2 主要特征
1.2.1 高度特異性 RNAi嚴格遵循堿基配對原則，只降解與之同源的基因的RNA，達到阻止基因表達的目的。
1.2.2 高效性 相對很少量的dsRNA分子（數(shù)量遠遠少于mRNA的數(shù)量）就能完全抑制相應基因的表達，在哺乳動物中雖沒發(fā)現(xiàn)擴增效應，但在細胞實驗中只需摩爾級濃度的 siRNA 即可有效抑制目標基因的表達。
1.2.3 可傳遞性和可遺傳性 RNAi抑制基因表達的效應可跨越細胞的界限，甚至可以傳播至整個有機體及子代細胞。
1.2.4 濃度、時間雙重依賴性 在一定時間內(nèi)RNAi的效應強度隨siRNA的濃度增高而增強，或濃度一定的情況下，隨著時間延長，siRNA在細胞內(nèi)發(fā)生正反饋效應，導致濃度增高，使RNAi效應增強。
1.2.5 ATP依賴性 目前研究發(fā)現(xiàn)RNAi中至少有2個步驟消耗ATP［5］：DICER酶切割dsRNA成為siRNA并使其5′端磷酸化或胞內(nèi)磷酸化酶使導入的siRNA 5′端磷酸化而使其成為有活性的siRNA的過程；RISC活化即siRNA解雙鏈的過程。
2 RNAi在消化系腫瘤治療中的應用
腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與原癌基因的激活，抑癌基因的失活，以及凋亡相關基因的異常表達等均有密切的關系。因此我們可以針對這些因素，利用RNAi相關技術(shù)在不影響正常基因功能的條件下抑制突變基因表達或基因的表達過量，從而達到基因治療的目的。另外，腫瘤是多個基因相互作用的基因網(wǎng)絡調(diào)控的結(jié)果，當單一癌基因的阻斷不能完全抑制或逆轉(zhuǎn)時，可以設計一種針對同一家族多個基因的保守序列的siRNA分子，便可以同時抑制這一家族的多個基因表達，且抑制效果互不干擾。
2.1 原癌基因
原癌基因是細胞基因組內(nèi)正常的組成成分，自然狀態(tài)下無致癌作用，其主要作用是通過編碼生長因子等調(diào)節(jié)正常細胞的生長、分化。原癌基因激活是腫瘤發(fā)生的根本原因之一，因此，如何抑制原癌基因的激活成為目前研究腫瘤治療的熱點之一。
2.1.1 Ras基因 Ras基因是目前已知的在人類腫瘤中呈活化狀態(tài)最普遍的原癌基因，有數(shù)據(jù)顯示此基因的突變現(xiàn)象存在于30%～50%的腫瘤組織中，在胰腺癌中可高達85%。Brummelkamp等［6］建立了突變體的表達系統(tǒng)即pSUPERKrasv12，轉(zhuǎn)染人胰腺癌CAPAN1細胞系后，觀察到pSUPERKrasv12能顯著降低Krasv12的mRNA表達水平。構(gòu)建突變體Krasv12的siRNA病毒載體轉(zhuǎn)染CAPAN1細胞亦能抑制細胞克隆生長，并阻止裸鼠腫瘤的形成；而對照組細胞生長良好并產(chǎn)生克隆，體內(nèi)裸鼠實驗5周內(nèi)均長出腫瘤，因此證明了該siRNA具有明顯的特異性和抑制腫瘤生長的作用。 同時，他們采用反轉(zhuǎn)錄病毒載體RNA系統(tǒng)在體外也成功地抑制了ras基因的表達。
2.1.2 Fos基因 Fos基因是一個重要的促進腫瘤細胞轉(zhuǎn)移的基因，其產(chǎn)物Fos蛋白與腫瘤細胞的運動有關。Fra1蛋白是Fos蛋白家族的成員之一，主要在大腸癌Hct116細胞株和BE細胞株中表達。用siRNA 轉(zhuǎn)染fosL基因，然后再轉(zhuǎn)染到BE細胞中，發(fā)現(xiàn)Fra1蛋白對細胞的增殖沒什么影響，卻極大地降低了BE細胞的運動能力，大約降低為原來的1/10［7］。
2.2 抑癌基因
由于抑癌基因在細胞增殖調(diào)控中起重要作用，因此也成為基因治療的重要目標之一。p53基因是最早利用RNAi技術(shù)研究的基因之一，人體內(nèi)大約50%腫瘤的發(fā)生是p53基因突變的結(jié)果。p53基因能夠抑制DNA合成及誘導DNA修復來抑制細胞生長，使細胞停滯在G1期。突變型p53失去對細胞增殖的負調(diào)控作用，導致細胞增殖失控發(fā)生癌變。Martinez等［8］的報道中，將H1299細胞轉(zhuǎn)染野生型p53和突變型p53的RNA表達型質(zhì)粒，結(jié)果，野生型siRNA明顯抑制野生型p53蛋白的表達，對突變型幾乎無效；而突變型siRNA顯著抑制突變型p53蛋白表達，野生型基因則不受影響。由此證明，RNA序列能特異性地分別抑制這兩個基因的表達，并且對突變型p53的抑制可在一定程度上恢復野生型基因的表達和功能。這就為選擇性和個體化治療腫瘤提供了可能。
2.3 細胞凋亡相關基因
細胞增殖和凋亡之間的動態(tài)平衡對于機體的生長發(fā)育有著舉足輕重的影響。凋亡過程的失調(diào)可能導致腫瘤的發(fā)生。有研究表明［9］，將表達有綠色熒光蛋白(GFP)的BclXLsiRNA轉(zhuǎn)染人胃癌細胞株MGC803，用RTPCR和免疫熒光法檢測BclXL的表達，48 h后發(fā)現(xiàn)，與siRNA陰性組相比，實驗組GFP明顯減少，BclXL蛋白和BclXL mRNA表達減少到基準水平以下，并有自發(fā)的細胞凋亡現(xiàn)象，凋亡率達21.17%。這就說明BclXL特異性siRNA能夠抑制凋亡抑制基因BclXL的表達，從而誘導胃癌細胞株MGC803凋亡。
2.4 其他相關基因
2.4.1 Her2基因 Her2基因在胃癌等腫瘤的發(fā)病中起到重要作用，尤其見于彌散型胃癌。有研究表明將核仁蛋白NoL8特異性siRNA轉(zhuǎn)染3種彌漫型胃癌細胞ST4，MKN45，TMK1，可以有效地降低該基因的表達，并能誘導這些細胞發(fā)生凋亡。因此，可以考慮把Her2作為胃癌基因治療的又一新的靶點［10］。
2.4.2 β連環(huán)蛋白和APC基因 β連環(huán)蛋白和APC基因是WNT信號傳導途徑的關鍵成分。這些基因的突變可引起β連環(huán)蛋白表達水平增加，導致細胞過度增生，促進結(jié)腸息肉和結(jié)腸癌的發(fā)生。Verma等［11］構(gòu)建了β連環(huán)蛋白的多個靶區(qū)域，使得蛋白表達量降低90%。有學者進一步用轉(zhuǎn)染β連環(huán)蛋白siRNA 的結(jié)腸癌HCT116細胞注射裸鼠，發(fā)現(xiàn)有50%的老鼠存活超過70 d，而對照組則全部死亡。
2.4.3 血管內(nèi)皮細胞生長因子（VEGF） VEGF是體內(nèi)一種重要的促血管生成因子，在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預后過程中均有著極其重要的作用。Zhang等［12］設計了針對鼠VEGF各亞型的siRNA，以DNA為模板在細胞內(nèi)誘導小片段雙鏈RNA的形成，干擾結(jié)果均特異性抑制相應VEGF的表達。同時，Takei等［13］設計了針對人VEGF的siRNA，采用體外合成法得到相應的siRNA，將其注入到荷瘤鼠模型的腫塊中。結(jié)果腫瘤組織中的VEGF在mRNA水平和蛋白水平的含量明顯低于對照組，腫瘤體積亦明顯小于對照組。徐文華等［14］設計兩組針對VEGFmRNA 的siRNA，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染人胃腺癌細胞系SGC7901，觀察其細胞周期的變化。發(fā)現(xiàn)G0/G1期細胞增多， S期細胞減少，細胞周期阻滯于G0/G1期;并能誘導細胞凋亡產(chǎn)生凋亡小體。這些結(jié)果無疑將給腫瘤的基因治療提供了新的思考方向。
2.4.4 TGFβ1 TGFβ1是一種多功能生長調(diào)節(jié)因子，與多種腫瘤的轉(zhuǎn)移關系密切。它可使胃癌細胞表達的黏附分子如CD44表達增多；抑制腹腔內(nèi)淋巴細胞活性使其無法有效殺傷腹腔內(nèi)游離癌細胞以及血管生成，同時可使間皮細胞變形，腹膜纖維化等。吳濤等［15］利用載體介導的RNAi技術(shù)干擾TGFβ1，發(fā)現(xiàn)TGFβ1蛋白在人胃癌細胞株SGC7901中下降約65.8%，腹膜間皮細胞TGFβ1蛋白下降約61.8%。這一結(jié)果有力證明了siRNA能抑制TFBβ1在人胃癌細胞株SGC7901和腹膜間皮細胞中的表達，為今后胃癌腹膜轉(zhuǎn)移靶向治療奠定了堅實的基礎。
2.4.5 埃茲蛋白(Ezrin) Ezrin作為ERM （ezrin radixin moesin)蛋白家族的成員，是一種細胞膜與細胞骨架的連接蛋白，其主要功能是參與細胞的生長和信號轉(zhuǎn)導，接受胞外信號，使骨架蛋白重新排布，并增加細胞運動能力。近來發(fā)現(xiàn)， Ezrin的表達與大多數(shù)腫瘤轉(zhuǎn)移相關，如Ezrin表達水平與黑素瘤的分級［16］和乳腺癌的發(fā)生轉(zhuǎn)移［17］均呈正相關。顏歌等［18］采用小干擾RNA 方法抑制腸癌細胞系Lovo和SW480中的Ezrin的表達，發(fā)現(xiàn)Ezrin mRNA和蛋白表達水平均顯著下調(diào)，腫瘤細胞的運動侵襲能力下降，穿過人工基底膜的細胞數(shù)量明顯減少。這預示Ezrin蛋白有可能成為抑制腸癌發(fā)展、轉(zhuǎn)移的新靶點。
2.4.6 多藥耐藥（multidrugresistance，MDR） MDR一直是腫瘤治療的棘手問題之一。研究證實抑癌基因Runx3的缺失和胃癌MDR相關， Guo等［19］應用siRNA敲除Runx3基因后發(fā)現(xiàn)癌細胞對多種化療藥物耐藥，將攜帶Runx3的真核生物表達載體轉(zhuǎn)染人類胃癌耐藥細胞系SGC7901，體外藥敏性分析顯示SGC7901 對各種化療藥物敏感。進一步分析顯示Runx3可以抑制MDR1和MDR相關蛋白1 (MRP1)啟動子的活性， Runx3的高表達可能通過下調(diào)MDR1，MRP1，Bcl2的表達，進而使胃癌細胞對化療敏感。另外，其中的MDR1基因的過度表達及其基因產(chǎn)物P糖蛋白增加是導致MDR的重要原因之一，Nieth等［20］設計了特異的siRNA分別處理胰腺癌EPG85257RDB細胞和胃癌EPG85181RDB細胞來抑制MDR1的表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn)這兩種細胞的MDR1的mRNA和蛋白表達量可降低90%以上，癌細胞對柔紅霉素的耐藥作用分別降低了89%和58%。這也提示我們，siRNA介導RNAi技術(shù)為克服腫瘤耐藥問題可能提供新的策略。
2.4.7 保羅樣激酶1（Pololike kinase 1， Plk1） Plk1是絲氨酸-蘇氨酸激酶之一，參與了有絲分裂的不同階段。Jang等［21］檢測發(fā)現(xiàn)280例胃癌患者中Plk1表達率高達95％（268/280），用RNAi的方法阻斷Plk1表達后，癌細胞的生長明顯受抑。用siRNA敲除Plk1基因后，細胞周期調(diào)節(jié)蛋白B的表達增加，胃癌細胞堆積于G2/M期，有絲分裂紡錘體形態(tài)異常，染色體分離延遲，胞質(zhì)分裂延遲或者停止，增殖減慢［22，23］。另外，Plk1基因的缺失亦伴隨癌細胞凋亡的增加，提示Plk1可能成為胃癌基因治療的理想靶點。
3 問題與展望
RNAi這一方興未艾的新技術(shù)，為腫瘤及其他疾病的基因治療提供了新的途徑。但是仍有許多問題亟待解決：①如何在體內(nèi)實現(xiàn)靶基因RNA轉(zhuǎn)移到所有腫瘤細胞并穩(wěn)定持久地抑制癌基因表達；②如何確定21～23 nt左右的核甘酸序列作為siRNA模板的選擇原則；③如何提高載體系統(tǒng)的效率等等?？傊?，RNAi技術(shù)作為一種研究的新工具，治療的新手段，隨著對其機制的不斷認識和技術(shù)的改進，必將在消化系腫瘤的研究及治療中擔任不可替代的角色，同時也預示著后基因組時代里一個嶄新的RNA時代的到來。
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1 ts、ts基因多態(tài)性和腫瘤基因組不穩(wěn)定性
1.1 ts
ts是由兩個相同亞單位組成的二聚體蛋白，相對分子質(zhì)量為72kda,是dna 合成的關鍵酶， 它催化脫氧尿苷酸（dump） 甲基化， 使之轉(zhuǎn)變?yōu)槊撗跣剀账幔╠tmp） 。ts 在dna合成與修復、細胞增殖與分化中有十分重要的作用,是腫瘤化療藥5fu和甲氨蝶呤等重要靶酶。
1.2 ts基因多態(tài)性
ts基因位于第18號染色體上(18p11.32),長16kb,主要轉(zhuǎn)錄起始位點位于atg起始密碼子上游160～180bp，增強子位于起始密碼子atg上游約400bp?；蚨鄳B(tài)性是指在正常人群中同一基因位點上存在兩種或兩種以上等位基因，且各等位基因皆具有相當高的頻率(頻率大于 1%)?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，ts 基因非翻譯區(qū)(untranslated region,utr )中存在多態(tài)性。多態(tài)性可以分為兩類，即長度多態(tài)性 (length polymorphism) 和位點多態(tài)性(site polymorphism)。
1.2.1 ts基因長度多態(tài)性 長度多態(tài)性可分為兩類：一類為串聯(lián)重復序列數(shù)目不同（variable number of tandem repeats,vntrs），如小衛(wèi)星；另一類長度多態(tài)性是基因的某一片段的缺失或插入所致，如微衛(wèi)星。
(1)5′utr串聯(lián)重復序列不同數(shù)目 啟動子是轉(zhuǎn)錄過程起始決定部位,對基因表達具有不可缺少調(diào)控作用。增強子是增強啟動子轉(zhuǎn)錄活性的dna序列。ts增強子區(qū)存在28bp串聯(lián)重復序列多態(tài)性，根據(jù)vntrs，分為含有重復2次的為2r、重復3次的為3r，見圖1。
更多重復次數(shù)等位基因(4r,5r,9r)出現(xiàn)頻率很少。因此,常見的三種基因型為3r/3r、2r/3r、2r/2r。
(2)ts基因3′utr 多態(tài)性 2000年，ulrich發(fā)現(xiàn)ts mrna 3′utr的1494bp處存在一個 6 個堿基缺失/插入多態(tài),形成+6bp/+6bp、+6bp/-6bp、-6bp/-6bp基因型。ulrich通過95名美國白人檢測ts 3′utr基因型分布，可能由于6bp等位基因頻率分布很低而將-6bp等位基因稱為變異型等位基因。而事實上英國白人、中國人等不少種族-6bp等位基因型占優(yōu)勢。因此我們認為將-6bp等位基因稱作變異型等位基因是不確切的［2］。
1.2.2 ts基因位點多態(tài)性 基因位點多態(tài)性是基因組中散在的堿基的不同，包括點突變、單個堿基的置換(又稱單核苷酸多態(tài)性,snp)、缺失和插入。mandola發(fā)現(xiàn)在5′utr 2r等位基因第一次重復序列和3r等位基因前兩次重復序列中均出現(xiàn)usf家族ebox(cacttg)。3r等位基因第二次重復序列第12個核苷酸等處存在gc snp，見圖1 ［1］。因而2r、 3r分別存在2g、2c和3g、3c等位基因型。2r/2r、2r/3g、2r/3c、3g/3g、3g/3c、3c/3c是6 種常見的基因型。snp是人類基因組中最廣泛的多態(tài)性現(xiàn)象，是造成個體差異的主要的遺傳原因,在目前人類基因組研究中倍受關注。
1.2.3 ts基因多態(tài)分布頻率存在種族差異 不同種族人群中ts基因多態(tài)分布頻率有很大差別。（1）2r,3r等位基因分布頻率在土耳其人中為42%
圖1 ts基因5′utr串聯(lián)重復序列多態(tài)性和單核苷酸多態(tài)性［1］
fig 1 the ts gene has a variable number of tandem repeats and single nucleotide polymorphism in the 5'untranslated region
和58%［ 3］，在中國人中分別為18.82%和81.00%，而在非洲人中相同。（2）美國白人ts 3′utr+6bp等位基因分布頻率為71%,中國人華北、華南地區(qū)人群分別為32%和30.9%［4］?；蚨鄳B(tài)分布頻率存在種族差異,顯示了遺傳背景的多樣性和復雜性,可能是人類在進化過程中抵御不良環(huán)境因素的一種適應性表現(xiàn)，對維持種群的生存與延續(xù)具有重要的生物學意義。
1.3 腫瘤的基因組不穩(wěn)定性
許多腫瘤還以基因組不穩(wěn)定、等位基因不平衡為特征。雜合缺失（loh）是等位基因不平衡的常見形式。loh是指來自父方或母方的一個等位基因的缺失。抑癌基因失活通常是在一個等位基因發(fā)生突變后，另一等位基因又發(fā)生loh。kawakami［5］等通過151例直結(jié)腸癌檢測5′utr重復序列基因型，50例雜合子中有31例發(fā)現(xiàn)2r、3r等位基因的不平衡,即出現(xiàn)loh。雜合性缺失(loh ) 與微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(msi)是基因組不穩(wěn)定性的兩個主要表型特征。抑癌基因缺失是許多腫瘤形成的關鍵步驟之一；復制錯誤也是不少腫瘤發(fā)生過程重要環(huán)節(jié)，能增加抑癌基因的突變。因而腫瘤組織ts基因分型，還要考慮基因組不穩(wěn)定性等因素。
1.4 ts基因多態(tài)性與ts表達水平的關系
ts基因多態(tài)性影響了 ts 基因 mrna 的穩(wěn)定和翻譯效率,導致不同基因型 ts表達效率不同。因此，ts基因多態(tài)性是ts表達水平高低及其可能存在亞型的主要影響因素。morganti等［6］通過48例結(jié)直腸癌患者研究顯示3r/3r基因型的癌組織ts mrna表達水平顯著高于2r/2r、 2r/3r基因型。mandola等對結(jié)直腸癌患者研究顯示ts3’tur6bp缺失與在體外降低了的tsmrna穩(wěn)定性相關，與在體內(nèi)瘤內(nèi)較低ts表達相關，可能會提高癌癥患風險；這與+6bp等位基因患乳腺癌風險率低的觀點一致［4］。
但也有部分學者認為，ts基因多態(tài)性與ts表達水平并不存在相關性。2001年kawakami［7］發(fā)現(xiàn)ts基因5′utr多態(tài)性與ts mrna的表達水平無關。
2 ts、ts基因多態(tài)性與腫瘤關系
2.1 ts基因多態(tài)性與腫瘤易感性
2.1.1 ts基因多態(tài)性與腫瘤易感性 人群中存在易感個體是由于一些與腫瘤發(fā)生相關的基因存在多態(tài)性。因此,不少學者認為，ts 基因多態(tài)性與患癌癥危險性密切相關。adleff等［8］報道3r等位基因與患結(jié)直腸癌風險升高相關，這可能是3r等位基因?qū)е聇s表達水平升高，促進細胞過度增殖、逃避衰老和凋亡的緣故。
2.1.2 ts基因多態(tài)性與腫瘤易感因素之間的相互作用 腫瘤的發(fā)生、發(fā)展受遺傳與環(huán)境因素共同作用的多因子疾病,基因基因、基因環(huán)境交互作用在發(fā)病中具有重要影響。(1) 基因基因交互作用。zhengdong zhang等研究顯示:tser 2r和 ts3'utr 6 bp等位基因在中國南方胃癌病因?qū)W中可能起到協(xié)同作用［9］，存在正交互作用。(2) 基因環(huán)境的交互作用。高長明［2］發(fā)現(xiàn)，ts6bp／-6bp基因型與吸煙、飲酒、和不飲茶的生活習慣在增加胃癌發(fā)生的危險性中有明顯的協(xié)同作用。（3）葉酸水平影響。人類紅細胞葉酸水平<140ng/ml或血漿葉酸水平<3ng/ml會誘發(fā)染色體損傷，增加患癌風險。ts5’utr 2r等位基因攜帶者，低葉酸攝入患結(jié)直腸癌風險顯著升高,兩者之間存在交互作用［10］。根據(jù)ts基因多態(tài)性與腫瘤易感性相關性，可以在癥狀出現(xiàn)以前作出基因診斷，對腫瘤的預測、預防、早期診斷等具有不可估量的價值。
2.2 ts與腫瘤化療
ts表達的調(diào)節(jié)依賴于細胞周期和細胞增殖狀態(tài)。在同步細胞中，當細胞從g0期進入到s期，ts活性水平增加約20倍。5fu是通過抑制ts而發(fā)揮其抗癌活性的。5fu進入體內(nèi)后,轉(zhuǎn)化為5氟尿嘧啶脫氧核苷(fdump),在輔因子5,10亞甲基四氫葉酸(ch2fh4)的存在下,能和ts結(jié)合形成等價的三連復合物tsfdumpch2fh4,影響ts與dump的結(jié)合,抑制了dtmp的合成,使dna合成受限,達到消滅癌細胞目的。最近zou k ［11］等用食管癌細胞株和結(jié)腸癌細胞株研究報道,胰島素能通過提高s期細胞數(shù)量、改變?nèi)B復合物水平而增強5fu的抗癌作用。
不少學者認為，ts水平與化療療效間存在負相關。banerjee等［12］報道以ts crna轉(zhuǎn)染腫瘤細胞，使ts高表達，細胞出現(xiàn)對5fu 和fdurd耐藥。以ts反義rna轉(zhuǎn)染dld1細胞，ts表達和活力受到明顯抑制，對5fu敏感性顯著增強［13］。ts基因表達水平在4.0×10-3以上的患者對化療通常均不敏感。以上研究表明,ts水平可預測腫瘤化療療效。
但也有不少學者不同意這種觀點。derenzini等［14］認為化療很大程度上受到腫瘤細胞動力的影響：對生長迅速的腫瘤效果更好。靶酶ts高表達腫瘤以5fu為主基礎的化療改善預后更好。關于ts與耐藥之間的關系,盡管各自結(jié)論有所不同,兩者之間相關性還是得到了大多數(shù)科學家的認同。部分學者通過ts表達水平與患者改善預后并不具備統(tǒng)計學差異而得出否定結(jié)論,忽視了療效預后受多因素影響的,所以不足以否定ts水平與化療療效間相關性。
在使用ts抑制劑化療時，腫瘤細胞可出現(xiàn)ts蛋白表達增強，稱為ts誘導。ts誘導會導致ts蛋白表達過度、催化活性升高，而導致腫瘤細胞耐藥。新型ts抑制劑洛拉曲克在ⅱ期臨床實驗中證實其對多種腫瘤具有很好的治療效果，但在短期運用后會誘導ts表達上調(diào)而導致腫瘤細胞對其耐藥。李亦蕾［15］等研究認為,降低ts誘導即可降低腫瘤細胞耐藥性。
2.3 ts基因多態(tài)性與腫瘤化療
遺傳藥理研究發(fā)現(xiàn)，患者對藥物的敏感性很大程度上取決于病人的遺傳結(jié)構(gòu)組成?；蚨鄳B(tài)性可引起不同個體在給藥時的藥理學及毒理學產(chǎn)生不同效果，從而引起藥物治療效果的差異。ts 基因 mrna 的穩(wěn)定和翻譯效率存在差異,并可導致不同 ts 基因型腫瘤患者對5fu為基礎的化療療效不同。因此多數(shù)學者認為ts基因型可作為腫瘤治療療效的預測指標。yawata等［16］藥敏研究顯示：2r/2r和2r/3r組細胞系比3r/3r組對fudr敏感性更高；2r/2r 、2r/3rc、3rc /3rc組（低ts表達組）細胞系對fudr敏感性比3rg/3rg組（高ts表達組）更高，表明對5′utr重復序列基因分型有助于指導個體氟尿嘧啶化療。高長明等［17］研究發(fā)現(xiàn)攜帶ts6/6bp和6/+6bp基因型患者化療有效率顯著高于+6/+6bp基因型患者。villafranca f等［18］研究也認為ts重復序列多態(tài)性可作為腫瘤降期的預測指標。ts基因多態(tài)性的研究有可能為化療方案制訂及預后評估提供了理論依據(jù)和指導。
2.4 ts及其基因多態(tài)性預測腫瘤化療療效存在局限性
不少學者認為，ts表達水平和ts基因型檢測可以預測腫瘤患者對化療藥物的敏感性和化療療效。然而有資料顯示，ts的表達與氟脲嘧啶有效性呈負相關的結(jié)論并不成立。lecomte等［19］對90例大腸癌研究表明，5′utr多態(tài)性和3′utr多態(tài)性與5fu療效和生存率無關。
出現(xiàn)這種相反觀點，一方面,可能在實驗過程中,電泳條件的差異和酶切不完全而產(chǎn)生假陰性,影響 ts 基因型的檢測結(jié)果,從而導致結(jié)論不一致;另一方面,影響腫瘤對5fu的敏感性有多種因素。除檢測了ts,胸苷磷酸化酶(tp)、胸苷激酶(tk)、二氫尿嘧啶脫氫酶(dpd)等與5fu代謝密切相關的其他酶應該檢測而沒有檢測,因而具有一定的局限性。p53、多藥耐藥基因和多藥耐藥相關基因等多種基因也是化療療效的影響因素。
2.5 ts相關耐藥逆轉(zhuǎn)
臨床化療失敗重要原因是腫瘤細胞產(chǎn)生耐藥性，尋找耐藥逆轉(zhuǎn)劑是抗腫瘤藥物研究的重要策略之一。目前逆轉(zhuǎn)ts高表達耐藥常用的是ecta方案、5fu聯(lián)用甲酰四氫葉酸(lv)或干擾素γ。 ecta方案使用nb1011等酶催化無毒性試劑。該無毒性試劑經(jīng)ts的催化才有毒性,所以對ts高表達耐藥癌細胞殺傷力強，而對正常細胞殺傷力弱，對ts誘導耐藥效果顯著,是一種理想逆轉(zhuǎn)劑。聯(lián)用lv或干擾素γ能降低ts誘導而避免繼發(fā)性耐藥發(fā)生。引導腫瘤細胞凋亡是化療最終途徑,5fu抑制ts,可能通過腫瘤細胞表面fas受體和fas配體結(jié)合而引導細胞凋亡［20］。這涉及信號傳導過程，因而有人提出了免疫治療方法。
ts抑制劑化療時，腫瘤細胞可出現(xiàn)ts誘導而耐藥。ferguson［21］等設計了與tsmrna3'utr互補的反義寡核苷酸，使tsmrna水平被抑制了70%，細胞增殖被抑制40%以上。兩者聯(lián)合治療可能克服ts上調(diào)所致的耐藥。peters等研究表明，高ts活性引導的腫瘤耐藥，在合并存在高dpd活性時明顯增強；對進展期結(jié)腸癌，低tsmran／低dpdmrna者使用5fu和亞葉酸鈣，高tsmrna／高dpdmrna者使用草酸鉑及cptⅱ，取得良好的臨床療效［22］。
2.6 基因治療
腫瘤的基因療法特別是自殺基因療法倍受關注，其原理是將自殺基因?qū)肽[瘤細胞，該基因編碼特殊的酶，可將原先無毒性的前藥在腫瘤細胞中代謝為毒性產(chǎn)物，從而引起這些細胞自殺。腫瘤自殺基因治療用于臨床，關鍵是使目的基因在腫瘤細胞異性表達，避免導入正常組織細胞中，保證基因治療安全性。為此，在自殺基因前端接上一個腫瘤特異性的啟動子，可以使自殺基因呈腫瘤特異性表達。于波等［23］將ts基因啟動子、p16基因啟動子重組質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)入耐藥hr8348細胞研究結(jié)果表明，ts和p16雙啟動子可引導tk基因靶向性殺傷5fu耐藥腫瘤細胞，保護機體正常細胞，提高自殺基因治療的安全性。黃慧敏等［24］通過逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導的rna干擾（rnai)技術(shù)，能夠間接抑制tsmrna的表達，為高表達ts的腫瘤基因治療提供了新的思路和手段。
2.7 ts、ts基因多態(tài)性與腫瘤侵襲性和預后
不少研究顯示，腫瘤ts的表達水平與患者的預后呈負相關， ts的表達可以作為判斷癌癥患者預后的指標。余之剛等［25］檢測164例胃癌標本顯示， ts表達水平高低與腫瘤分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否及臨床病理分期密切相關。ts高表達預示著腫瘤具有較強的侵襲性，ts基因產(chǎn)物低表達患者的局部復發(fā)率和遠處轉(zhuǎn)移率均明顯低于高表達患者。它在dna合成中發(fā)揮作用,過度表達ts腫瘤細胞群可能具有優(yōu)勢潛能，高ts表達與不良預后相關可能是細胞增生狀態(tài)的反映。也有學者研究得出不同結(jié)論，董稚明等［26］通過51例食管癌標本ts表達檢測結(jié)果表明，ts表達水平與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床病理分期無關。
腫瘤病變的分子特征決定了腫瘤的惡性特征、轉(zhuǎn)移特征、復發(fā)特征，是腫瘤的預后判斷的基本依據(jù)。董稚明等［26］研究提示，ts 5'utr多態(tài)性分析可能作為預測食管鱗狀細胞癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移能力的分子指標。可見人群基因型可能與腫瘤分級、分期有關，對預測腫瘤預后有一定意義；對腫瘤進行分子分型,可能會使醫(yī)生對病情和發(fā)展趨勢的預后判斷更細致、更正確，對療效監(jiān)控情況更清晰。
3 結(jié)束語與展望
化療在腫瘤綜合治療中有著重要的價值，耐藥仍是腫瘤化療一大難題。不同學者報道結(jié)論有所不同，這可能由于隨著研究人群、年齡、地域、觀察終點和方法不同而有所差異。組織大樣本隨機對照研究，系統(tǒng)評估,進一步研究ts及其基因多態(tài)性與腫瘤關系,將有助揭開腫瘤細胞耐藥的機制。根據(jù)ts、ts基因型檢測指導個體化療，可提高用藥針對性和有效性，減少用藥的盲目性及其毒副作用。不少學者認為，ts及其基因型檢測有望成為預測腫瘤發(fā)生、化療療效評估、預后判斷的指標，將為腫瘤防治帶來美好前景。未來個體化醫(yī)學，相信會建立在循證醫(yī)學基礎上，以基因組學和蛋白質(zhì)組學為依托的個體化腫瘤綜合診療模式。但目前國內(nèi)外對ts基因3′utr 多態(tài)性、snp和腫瘤的基因組不穩(wěn)定性報道不多,對ts相關耐藥的逆轉(zhuǎn)和有關ts基因治療研究甚少，有待進一步研究。
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【摘要】 目的 研究Med19基因在胃癌MGC803細胞中沉默后對細胞增殖和周期的影響。方法 應用shRNA慢病毒載體感染胃癌MGC803細胞沉默Med19基因，通過MTT和克隆形成實驗觀察Med19基因在胃癌細胞增殖中的作用，并用流式細胞術(shù)驗證抑制Med19基因?qū)毎芷诘挠绊?。結(jié)果 構(gòu)建的shRNA慢病毒載體感染MGC803細胞后細胞增殖能力顯著降低、細胞克隆形成能力明顯減弱，同時，細胞周期阻滯于G1期。結(jié)論 Med19基因沉默后胃癌細胞的增殖能力和細胞周期均受到顯著影響，提示Med19在腫瘤形成過程中具有重要作用。
【關鍵詞】 胃癌;Med19;RNAi;增殖;細胞周期
中介體(Mediator)最早發(fā)現(xiàn)于酵母菌中，是由多個蛋白質(zhì)亞基組成的生物大分子復合物，屬于RNA 聚合酶Ⅱ通用轉(zhuǎn)錄裝置的基本組分，在真核生物mRNA 合成的活化和抑制中發(fā)揮關鍵作用，對RNA聚合酶Ⅱ活力進行調(diào)節(jié)〔1～3〕。哺乳動物中介體的亞基組成及其相關活性已經(jīng)確定，目前已鑒定30余種亞基，其中多數(shù)亞基與酵母的中介體亞基存在廣泛的同源性〔4，5〕。Med19是中介體其中一個亞單位，又稱為肺癌轉(zhuǎn)移相關蛋白(lung cancer metastasis related protein l， LCMR1)。最初由高轉(zhuǎn)移肺癌中克隆得到，已被證實參與細胞信號由胞外向胞內(nèi)轉(zhuǎn)導。抑制Med19基因，可引起某些調(diào)節(jié)細胞生長、細胞分化和凋亡的基因的表達發(fā)生改變，提示Med19可能參與細胞周期調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導或轉(zhuǎn)錄調(diào)控〔6〕。本研究利用慢病毒介導的RNAi方法在胃癌MGC803細胞中沉默Med19基因，觀察其影響細胞增殖和細胞周期的能力，從而對Med19基因在胃癌中的功能進行驗證。
1 材料與方法
1.1 Med19基因shRNA 慢病毒載體的構(gòu)建 靶向Med19基因的siRNA序列3′AAGGTGAAGGAGAAGCTAAGT5′，由上海生工公司合成短發(fā)卡結(jié)構(gòu)的雙鏈DNA(shRNA)，重組進入慢病毒質(zhì)粒pLVTHM，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞并挑選重組克隆進行菌落PCR鑒定，測序驗證后的shRNA慢病毒載體大量擴增，與包裝輔助質(zhì)粒psPAX2、pMD2G共轉(zhuǎn)染至病毒包裝細胞293T，12 h后換液，轉(zhuǎn)染72 h收集細胞上清，并裂解細胞，用微孔濾膜過濾除菌，超速離心后棄上清液，用冰PBS溶液重懸病毒沉淀，得到shRNA慢病毒包裝顆粒，有限稀釋法通過熒光觀察標定病毒滴度。
1.2 慢病毒介導RNAi沉默Med19基因的效率驗證 pLVTHMsiMed19載體包裝的慢病毒顆粒感染胃癌MGC803細胞，72 h后熒光顯微鏡下觀察GFP的表達情況，通過計算在白光下細胞總數(shù)與綠色熒光細胞的比值，得到GFP的陽性表達率，可知慢病毒對MGC803細胞感染率達到85%以上。感染后的第5天抽提細胞總RNA，通過RTPCR法檢測shRNA慢病毒對Med19 mRNA表達的抑制作用;同時裂解細胞收集總蛋白，Western印跡法驗證Med19蛋白水平表達的變化，確認shRNA慢病毒對Med19基因的阻斷效應。
1.3 MTT方法檢測細胞增殖情況 實驗共分為三組：shRNA慢病毒感染組(shRNA組，靶向Med19基因的shRNA慢病毒)、非特異性的shRNA陰性對照病毒感染組(NC組，對照序列shRNA慢病毒)和空白對照組(C組，MGC803細胞未作任何處理)。取對數(shù)生長期細胞MGC803細胞接種于96孔板中，計數(shù)細胞每孔2 000個，每組5個復孔，接種5塊復板。接種第2天加MTT(5 mg/ml)10 μl/孔，4 h后吸出培養(yǎng)基，加入DMSO 100 μl/孔。5 min后酶標儀檢測OD570吸光度值，連續(xù)檢測5 d。每天一塊復板。根據(jù)MTT讀值繪制細胞生長曲線。
1.4 細胞克隆形成實驗 實驗分組同前，shRNA慢病毒感染后的MGC803細胞制備成細胞懸液，接種于6孔板，每孔200個細胞，將接種好的細胞于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)到絕大多數(shù)單個克隆中細胞數(shù)大于50為止，中途進行數(shù)次換液并進行細胞狀態(tài)觀察，連續(xù)觀察14 d。實驗終止前熒光顯微鏡下對細胞克隆進行拍照，終止時用PBS溶液洗滌細胞2次，多聚甲醛固定細胞40 min，PBS溶液再次洗滌后用GIEMSA染色液對細胞染色10 min，去離子水清洗細胞3次去除背景，晾干、拍照和計數(shù)克隆。
1.5 流式細胞儀檢測細胞周期 實驗分組同前，感染shRNA慢病毒的MGC803細胞接種于6孔板中，細胞固定時先用胰酶消化，待細胞呈圓形未脫落時，完全培養(yǎng)基終止，4℃預冷的PBS洗滌細胞沉淀2次，2 000 r/min、5 min收集細胞，然后邊震蕩邊加入70%的冰冷乙醇1 ml固定細胞，4℃過夜。冰PBS洗滌細胞2次后，2 000 r/min離心5 min收集細胞1 ml冰PBS溶液重懸細胞沉淀，分別加入PI(1∶40)及RNase(1∶100)，避光冰浴15 min，上機進行流式檢測。
1.6 統(tǒng)計數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)采用軟件SPSS16.0進行統(tǒng)計學分析，應用一維方差分析比較顯著性。
2 結(jié) 果
2.1 shRNA慢病毒介導Med19基因沉默效果 采用針對Med19基因的PCR引物，以βactin為內(nèi)參，進行mRNA的定量檢測。shRNA慢病毒感染組(shRNA組)、陰性對照病毒感染組(NC組)和空白對照組(C組)mRNA結(jié)果見圖1，mRNA水平基因抑制效率達到78.4%。同時，Western印跡實驗結(jié)果中同樣證實shRNA組Med19蛋白的表達量與NC組相比明顯減少，表明shRNA慢病毒感染MGC803細胞后可以高效抑制Med19蛋白的表達，見圖1。
圖1 shRNA慢病毒在MGC803細胞中
對Med19基因的抑制效率
2.2 shRNA慢病毒介導Med19沉默抑制胃癌MGC803細胞增殖 在MTT實驗方法中，OD570nm處的吸光值可間接反映出細胞增殖的情況，即OD570 nm值越大，細胞活力越強。MTT法檢測轉(zhuǎn)染后1～5 d各組細胞的吸光度值，以培養(yǎng)時間為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制生長曲線。對各組細胞同一檢測點的吸光度值進行統(tǒng)計分析，結(jié)果顯示，Med19 shRNA慢病毒感染組MGC803細胞的570 nm OD值顯著低于其他兩組，表明MED19基因沉默后MGC803細胞增殖明顯受到抑制，細胞活力下降，而陰性對照組和空白對照組OD570 nm值基本一致，說明慢病毒本身對MGC803細胞增殖能力無影響，從而也證實由于shRNA慢病毒介導了MGC803細胞中Med19基因的沉默導致了細胞增殖能力下降，見圖2。
圖2 MGC803細胞增殖曲線
2.3 Med19基因沉默降低MGC803細胞克隆形成能力 從單個克隆看，陰性對照組和空白對照組細胞數(shù)目較多且兩組相差不大，而shRNA慢病毒感染的MGC803克隆中細胞數(shù)比其他兩組顯著減少，見圖3。同時，克隆計數(shù)結(jié)果表明，Med19沉默后細胞克隆數(shù)(42.7±7.1)與陰性對照組(124.3±22.8)和空白對照組(147.3±28.5)克隆數(shù)相比顯著降低，表明抑制Med19基因能夠降低胃癌MGC803細胞克隆形成能力。表1 PI染色流式細胞儀檢測細胞周期結(jié)果
2.4 Med19基因沉默引起MGC803細胞周期阻滯于G1期 應用PI染色細胞進行流式細胞術(shù)觀察Med19基因沉默后對胃癌MGC803細胞周期的變化。從表1數(shù)據(jù)可以觀察到，與陰性對照相比，抑制Med19能夠使G1期細胞增多，G2/M期細胞減少，差異具有顯著性。由此可見Med19基因RNAi后細胞周期阻滯于G1期，細胞復制能力降低，驗證了其表達對胃癌細胞具有促進增殖的作用(圖4)。
圖4 MGC803細胞周期峰型圖
3 討 論
在世界范圍內(nèi)胃癌死亡率居惡性腫瘤第二位，由于飲食結(jié)構(gòu)等因素影響，目前全球約60%的胃癌新發(fā)病例發(fā)生在中國、日本等東南亞國家。外科手術(shù)是目前胃癌治療的最有效手段，但術(shù)后5 年生存率較低。據(jù)2009年統(tǒng)計，胃癌病人術(shù)后5年的總體生存率低于25%〔7〕。胃癌發(fā)生的分子基礎是以癌基因的激活與抑癌基因的失活為基礎的多步驟、多階段效應過程，通過這些基因表達產(chǎn)物的改變，引起細胞惡性增殖、去分化和侵襲性生長，從而導致癌變過程。從治療策略看，控制癌基因的激活和抑癌基因的失活能夠阻斷腫瘤的發(fā)生。自RNA干擾(RNAi)技術(shù)應用以來，其高效性、特異性和低毒性使得該技術(shù)在反向基因組學、基因治療、抗腫瘤、抗病毒、抗遺傳性疾病以及胚胎干細胞的研究中顯示了巨大的潛力〔8，9〕。
Med19基因在酵母中又名ROX3 (或SSN7、RMR1等)，最初是在觀察cyc7基因突變時發(fā)現(xiàn)的〔10〕，研究證實Med19編碼產(chǎn)物屬于中介體和RNA聚合酶Ⅱ全酶的亞基〔11〕。Med19/Rox3構(gòu)成了酵母RNA聚合酶Ⅱ的頭部組件〔12，13〕。缺失Med19/Rox3能夠?qū)е轮薪轶w中部組建的解離，僅保留由頭部和尾部模塊組成的亞復合體，提示Med19可穩(wěn)定中部組件在中介體的位置，而對頭部和尾部組件無影響。此外，突變的Med19/Rox3中介體對RNA聚合酶Ⅱ的親和力下降，無法刺激 RNA聚合酶Ⅱ亞基羥基端結(jié)構(gòu)域(Carboxy terminal domain， CTD)的磷酸化〔14〕。最近，Med19和Med26被確定為沉默轉(zhuǎn)錄因子RE1操縱的調(diào)控裝置的重要組分〔15〕。RE1沉默轉(zhuǎn)錄因子以Med19/Med26為橋梁招募中介體，以使非神經(jīng)元細胞中的神經(jīng)元特異性基因?qū)崿F(xiàn)表觀遺傳沉默。
Med19在腫瘤中的研究還不完善，但關于Med19在胃癌組織中的表達問題已在本人的前期研究中得到證實和闡述，應用免疫組化組化方法檢測Med19在胃癌、癌旁和正常組織中的表達，證實Med19在腫瘤組織中的高表達具有特異性，該基因的表達上調(diào)可能涉及胃癌癌變的發(fā)生。但是Med19對細胞增殖和周期的影響尚未闡明。我們在沉默Med19基因后，通過MTT法、克隆形成實驗、流式細胞儀測定細胞周期以及Transwell實驗觀察細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的變化，結(jié)果顯示RNAi組與對照組相比， MGC803細胞的增殖能力顯著降低，克隆形成能力減弱，細胞，細胞周期出現(xiàn)G1期阻滯，但對細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力沒有顯著的影響。本部分實驗證實了利用RNAi技術(shù)抑制胃癌細胞Med19基因，能夠有效地抑制胃癌細胞的惡性表征，提示在胃癌中靶向基因治療中Med19可能成為有效的靶位點，具有良好的應用前景。
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關鍵詞：人工核酸內(nèi)切酶：基因編輯：CRISPR/Cas9
中圖分類號：Q789
文獻標識碼：A
文章編號：1007-7847（2015）03-0276-07
基因組定點編輯技術(shù)是研究基因功能的一種重要手段，同時也是許多基因相關疾病的潛在治療方法。早期主要依賴于基因同源重組及體細胞核移植技術(shù)來完成對特定基因的改造，然而自然情況下基因重組效率極低，且細胞核移植技術(shù)費時費力[1，2]，嚴重制約了基礎研究和臨床應用。因此，在不斷尋求高效、簡便的基因編輯方法過程中，人工核酸內(nèi)切酶（engineered endonuclease.EEN）介導的基因定點編輯技術(shù)快速發(fā)展成為一種主流方法。
人工核酸內(nèi)切酶進行基因編輯的第一步是在修飾位點誘導產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂缺口（doublestrand breaks，DSB）。核酸酶誘導產(chǎn)生的DSBs可借助非同源末端連接（non homologous end-join-ing，NHEJ）機制或同源重組（homologous recombi-nation，HR）機制進行修復。NHEJ將斷裂的雙鏈末端直接連接起來，可有效地引起基因的插入/缺失突變，即inclel突變，從而使基因的功能遭到破壞。當引入模板DNA序列時，可通過同源重組修復（HR），插入或刪除特定的基因序列。通過人工核酸內(nèi)切酶介導的DSBs，基因突變的幾率大于1010，有時甚至超過50%[3] ，因此，人工核酸內(nèi)切酶被稱為“DNA剪刀”。鋅指核酸內(nèi)切酶（zinc finger en-donuclease，ZFN）和類轉(zhuǎn)錄激活因子效應物核酸酶 （Lranscriplion activator-like effector nuclease，TALEN）分別作為第一代和第二代“DNA剪刀”，都是由DNA結(jié)合蛋白與核酸內(nèi)切酶Fok I融合而成。但由于這兩種人工核酸內(nèi)切酶制備復雜，成本昂貴，難于開展大規(guī)?；蚓庉嫷暮Y選，使其應用有所局限。近年來，細菌獲得性免疫系統(tǒng)CRISPR （clustered regularly interspaced shortpalinclromic repeats）的應用使得基因組編輯技術(shù)進一步簡化.CRISPR/Cas9作為第3代人工核酸內(nèi)切酶迅速成為目前研究的熱點，其獨特性和靈活性在于該系統(tǒng)是通過RNA介導核酸酶與靶DNA序列結(jié)合的。與以DNA結(jié)合蛋白為基礎的ZFN和TATJFJN相比，以RNA介導的CRISPR/Cas9系統(tǒng)原理更加簡單，只需要遵循RNA與DNA之間的堿基互補配對原則。
本文重點介紹了CRISPR/Cas9的作用機理及其應用，最后就CRISPR/Cas9技術(shù)目前存在的問題及其應對策略進行了探討。
1 CRISPR/Cas9的結(jié)構(gòu)及作用機理
CRISPR廣泛存在于細菌和古細菌的基因組中，是細菌和古細菌的一種適應性免疫系統(tǒng)，該系統(tǒng)可以介導外源DNA的降解，從而抵御病毒等外來入侵者[4，5]。1987年，日本學者首次在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)該間隔重復序列[6]；2002年，Jansen等[7，8] 將其正式命名為CRISPR，基因編碼的蛋白質(zhì)統(tǒng)稱為CRISPR附屬蛋白（CRISPR-associa七ion pro-teins，Cas）。CRISPR/Cas系統(tǒng)具有Type I、TypeⅡ、TypeⅢ3種不同類型，其中研究最多、應用最廣的是Ⅱ型CRISPR/Cas系統(tǒng)。產(chǎn)膿鏈球菌（Strepto-coccus pyogenes SF370）的Ⅱ型CRISPR基因座主要由三部分組成，包括Cas9核酸酶基因、不編碼蛋白質(zhì)的tracr RNA基因和CRISPR基因（圖1），其中CRISPR基因由前導序列（leader sequence）、間隔序列（ spacers）和重復序列（repeats）組成[9] 。CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導的適應性免疫主要分為3個步驟。首先是新的間隔序列的獲取：外來質(zhì)?；虿《綝NA首次入侵時，Ⅱ型CRISPR系統(tǒng)將外來DNA整合入CRISPR重復序列之間形成一段新的間隔序列，并隨著宿主DNA -起編碼；其次是crRNA的表達、加工與成熟：CRISPR重復序列和間隔序列經(jīng)轉(zhuǎn)錄加工為pre-crRNA，tracrRNAs與pre-crRNA的重復序列區(qū)域配對雜交，然后內(nèi)源性的RNaseⅢ從每一個間隔序列的5'端裂解雜合的pre -crRNA -tracrRNAs，產(chǎn)生成熟的tracr-RNA-crRNAs，并與Cas9核酸酶結(jié)合[10] ；最后，當同樣的外源DNA再次出現(xiàn)時，CRISPR-Cas復合體可與雙鏈DNA的靶位點結(jié)合并切割雙鏈。靶標的識別和DNA鏈的裂解既需要間隔序列和靶序列之間的互補，又需要靶DNA序列3'端存在PAM （Protospacer adjacent motif）序列[11]，PAM序列的存在還避免了CRISPR基因本身被作為靶標識別，提供了一個識別“自己”和“異己”的機制。不同的Ⅱ型CRISPR系統(tǒng)有不同的PAM序列，基于產(chǎn)膿鏈球菌CRISPR系統(tǒng)的PAM序列為NGG，N指的是任意核苷酸[10] 。
Cas9實際上是一種核酸酶，它具有兩個獨立的核酸酶位點：一是HNH核酸酶位點，可以斷裂與crRNA互補的那條鏈；另一個是類似于RuvC核酸酶位點，可以裂解另一條非互補鏈。研究[12，13]發(fā)現(xiàn)Cas9家族的所有成員都具有相同的結(jié)構(gòu)核心，這個結(jié)構(gòu)核心的特征為一種具有兩個主葉（major lobe）-核酸酶結(jié)構(gòu)域葉和a-螺旋葉的結(jié)構(gòu)，其中核酸酶結(jié)構(gòu)域葉是由HNH結(jié)構(gòu)域、RuvC結(jié)構(gòu)域以及與PAM序列相互作用的C末端結(jié)構(gòu)域組成。這兩個主葉含有保守性的裂縫，而這些裂縫在核酸結(jié)合中發(fā)揮功能。Cas9蛋白本身以非活性的狀態(tài)存在，它的核酸酶活性被C末端結(jié)構(gòu)域的方向所抑制，而且不能與DNA結(jié)合；但當其與crRNA-tracrRNA復合體結(jié)合時，這種蛋白的兩個主葉之間就會構(gòu)建出一條作為DNA結(jié)合界面發(fā)揮功能的通道，從而在結(jié)構(gòu)上激活Cas9，使得它能夠與靶DNA結(jié)合，PAM序列則將其核酸酶活性激活[12―14]。
2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的應用
目前，來自于產(chǎn)膿鏈球菌的Ⅱ型CRISPR系統(tǒng)已被改造為基因組定點編輯的工具。該系統(tǒng)具備兩個最基本的成分：一個是起識別作用的cr-RNA-tracrRNA序列，另一個是起切割作用的Cas9核酸酶。在對哺乳動物細胞進行基因編輯時，需要對Cas9蛋白編碼基因進行優(yōu)化以及添加合適的核定位信號；此外，還需考慮是分別表達crRNA和tracrRNA還是嵌合成一條crRNA -tracrRNA，crRNA -tracrRNA又稱向?qū)NA（ gR-NA）c15]。
自2012年首次證明CRISPR/Cas9系統(tǒng)可以在體外切割不同的DNA[10]以來，該系統(tǒng)已經(jīng)成功地應用于細菌、酵母、番茄、擬南芥、大米、小麥、高粱、鼠、兔子、青蛙、果蠅、蠶、線蟲、斑馬魚及人類細胞等的基因編輯中[3]。與其他人工核酸酶相比.該RNA介導的基因編輯系統(tǒng)一個顯著的優(yōu)勢就是可以同時在多個不同的DNA位點進行基因編輯。例如，Cas9和多個gRNAs的同時表達，可在DSBs間造成大片段的刪除和插入[16，17]；可在鼠細胞中同時誘導3個基因的突變[18]；在斑馬魚體細胞中導致5個基因的同時突變等[19]。
Cas9除了可以用于基因的編輯外，還可以對基因的表達進行調(diào)控。當Cas9核酸酶的兩個催化位點全部突變時，Cas9就變成了沒有核酸酶活性的蛋白質(zhì)（稱為dCas9）；研究表明，dCas9可以結(jié)合在基因的啟動子上來抑制基因的表達[20，21]。當gRNA結(jié)合在啟動子的上游時，無論其結(jié)合在DNA的哪條鏈上，dCas9都可以有效地抑制轉(zhuǎn)錄的發(fā)生；然而，當結(jié)合在轉(zhuǎn)錄起始位點的下游時，只有當gRNA結(jié)合在非模板鏈時，dCas9才能起抑制作用[20]。此外，dCas9還可以作為一個平臺招募各種效應因子結(jié)合在特異的基因位點上。例如，在人類細胞[22-25]和小鼠細胞[2q中，結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活子或者轉(zhuǎn)錄抑制子的dCas9可以對基因的表達起到調(diào)節(jié)作用（圖2A）。并且，如果有2―10個gRNA介導多個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合在同一基因位點，可以進一步提高基因調(diào)節(jié)的效率，推測與轉(zhuǎn)錄因子之間的協(xié)同作用相關[22，23，26，27]。也有研究利用EGFP-dCas9融合物來識別包含重復序列的DNA位點，例如端粒[28]（圖2B），若DNA位點包含有重復序列，則會結(jié)合有多個EGFP蛋白，為研究染色體的動力學和結(jié)構(gòu)提供了一種有力的手段，并且使Cas9系統(tǒng)的應用不僅局限于基因的表達范圍。
這種簡便高效的CRISPR/Cas9技術(shù)填補了哺乳動物細胞內(nèi)基于基因完全敲除而進行的大規(guī)?；蚬δ苄院Y選方法的空白，可以針對細胞全部基因或某些基因構(gòu)建gRNA文庫，然后經(jīng)過慢病毒載體轉(zhuǎn)染進行大規(guī)模的篩選。已有研究團隊針對人類的部分291個基因構(gòu)建了包含有869種gRNA的文庫，并且成功地鑒別出了對于炭疽和白喉毒素毒性事關重要的宿主基因[29]。也有研究報道針對人類或小鼠的全部基因組構(gòu)建了包含有64 000～87 000條gRNA的文庫，通過高通量的敲除技術(shù)對人類和小鼠細胞進行了基因的功能性篩選鑒定[30-32]。其技術(shù)路線大致相同，都是通過構(gòu)建gRNA慢病毒表達載體來感染細胞，然后通過功能性篩選鑒定細胞，最后經(jīng)過二代基因測序[33] 確定相關的基因。不同之處在于，有的團隊[31]將gRNA和Cas9串聯(lián)表達在同一個慢病毒表達載體上，通過感染將二者一次性轉(zhuǎn)入細胞；而有的團隊[30，32] 將二者分別克隆在不同的載體上，先獲得穩(wěn)定表達Cas9的細胞，然后再進行g(shù)RNA慢病毒的感染。盡管RNA干擾（RNA interference，RNAi）文庫[34]也曾被廣泛應用于功能缺失型基因篩選，但是與gRNA文庫相比，RNA干擾只是下調(diào)某些基因的表達，常常造成不穩(wěn)定的表型變化，并且文庫構(gòu)建繁瑣，價格昂貴；而gRNA文庫的構(gòu)建和篩選都非常的簡單，在基因的功能性篩選鑒定方面發(fā)揮了重要作用。
除此之外，CRISPR-Cas系統(tǒng)也可以用來快速地建立轉(zhuǎn)基因細胞和動物模型。一些人類疾病例如糖尿病、心臟病、精神分裂癥是與多個基因有關的，CRISPR多基因同時編輯的特點為這些疾病模型的建立提供了很好的方法[35，36]。利用傳統(tǒng)方法建立動物疾病模型要花費1年多的時間，而使用CRISPR技術(shù)只需幾周即可完成。而且，傳統(tǒng)方法只能用于傳統(tǒng)動物的建模，靈長類動物體內(nèi)基因精確修飾一直是個難題，但最近一個研究小組在猴子體內(nèi)利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)實現(xiàn)了精確的基因修飾[37]為我們提供了一種研究人類疾病的新策略。
3 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的脫靶效應及提高特異性的策略
【關鍵詞】胃腫瘤；抑癌基因；Runx3
Runx3（PEBP2αC/CBFA3/AML2）基因是一個腫瘤抑制基因，其功能缺失與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關。自2002年日本學者Li等［1］首先報道Runx3有調(diào)節(jié)胃上皮細胞的增生與凋亡平衡的作用以來，Runx3與胃癌發(fā)生、發(fā)展的相關研究已成為胃癌研究領域的熱點。現(xiàn)對Runx3與胃癌的研究現(xiàn)狀做一綜述。
1Runx3基因、蛋白結(jié)構(gòu)及其功能
Runx3來自Runt結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子（Runtdomaintranscriptionfactors），是轉(zhuǎn)錄因子Runx家族成員之一，Runt區(qū)域轉(zhuǎn)錄因子也稱PEBP2/CBF（polyomavirusenhancer-corebindingprotein2/corebindingfactor），是TGF-β超家族信號重要的靶目標，在哺乳動物生長過程中扮演重要角色。該基因家族在哺乳動物有3個成員Runx1、Runx2、Runx3，它們的產(chǎn)物都是由α和β亞單位構(gòu)成的異二聚體［2］，具有不同生物學功能，Runx1與造血功能有關，Runx2是重要的骨生成調(diào)節(jié)因子，Runx3對脊神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)發(fā)育及胃黏膜上皮細胞的增生調(diào)控和T細胞的分化起重要作用［1，3］。
Runx3（Runtrelatedtranscriptionfactor3gene）基因位于人染色體的1p36.1，基因全長約67kb，含有P1和P2兩個啟動子，6個外顯子和1290bp的開放閱讀框，內(nèi)含子1跨越了整條基因全長的一半（35kb）。兩個啟動子區(qū)域均含數(shù)個分離的轉(zhuǎn)錄起始點，其中Runx3mRNA主要來自于P2啟動子的轉(zhuǎn)錄［3］。兩個啟動子的GC含量不同，P2啟動子GC含量高（64％）。在外顯子2相當于啟動子P2的位置和外顯子6的起始部位有兩個大CpG島［4］。
人類Runx3蛋白是α、β兩個亞單位構(gòu)成的異二聚體，包含415個氨基酸殘基，α亞單位含有一個RD（Runtdomain）保守域，RD位于Runx蛋白的氨基酸末端，由128個氨基酸組成，介導Runx蛋白與DNA結(jié)合以及蛋白質(zhì)之間的相互作用［5，6］。α亞單位介導RD與靶DNA結(jié)合，β亞單能增強RD與靶DNA的結(jié)合力［7］。
Runx蛋白的羧基端富含脯氨酸和絲氨酸，對基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控起重要作用［2，7］。
2Runx3與胃癌的相關研究及其抑癌機制
2.1Runx3與胃黏膜的關系Li等［1］研究發(fā)現(xiàn)敲除Runx3（Runx3-/-）的小鼠胃黏膜明顯增厚，Runx3-/-小鼠培養(yǎng)細胞對TGF-β誘導的生長抑制和凋亡作用不敏感，且Runx3-/-小鼠胃組織中半胱天冬酶3（caspase3）無活性［1］。Fukamachi等［8］研究發(fā)現(xiàn)Runx3缺失時胃黏膜細胞處于低分化狀態(tài)。這些觀察表明Runx3是胃黏膜上皮主要生長調(diào)控因子，是胃上皮細胞中重要的致凋亡因素。
2.2胃癌中Runx3表達情況研究發(fā)現(xiàn)，胃癌中Runx3的表達明顯下調(diào)或缺失。Li等［1］應用RT-PCR、Southernblot和原位雜交方法對15株胃癌細胞系和46例胃癌組織標本的Runx3mRNA表達進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)47%的胃癌細胞系中Runx3無或低表達;60.9%的胃癌組織中Runx3無表達或低表達，Runx3的表達率與胃癌臨床分期呈負相關。所以認為Runx3基因與胃癌的發(fā)生、發(fā)展有著極其密切的關系，并且隨著胃癌分期的增高表達進一步降低。Osaki等［9］應用Western印跡法分析了6株胃癌細胞系Runx3蛋白質(zhì)的表達情況，結(jié)果50%的細胞系Runx3表達陽性，與Li等報道的結(jié)果基本一致;此外，還通過免疫組化法揭示83例正常胃黏膜組織均有Runx3表達，而對應的腸上皮化生組織和癌組織中均無Runx3表達［9］。
2.3Runx3與胃癌的相關性Li等［1］報道Runx3-/-、p53-/-小鼠胃黏膜培養(yǎng)細胞能建立裸鼠種植腫瘤（腺癌），而Runx3+/+、p53-/-小鼠胃黏膜上皮培養(yǎng)細胞則不能，這表明Runx3功能缺失可能誘導了胃癌的發(fā)生。Guo等［10］以胃癌細胞系（Runx3-/-）作為感受態(tài)細胞，將外源性Runx3基因分別轉(zhuǎn)染克隆體，結(jié)果顯示，Runx3高表達克隆組細胞生長抑制最明顯，Runx3低表達組次之，說明Runx3的表達量與胃癌細胞的生長曲線成負相關。Sakakura等［11］研究發(fā)現(xiàn)胃癌原發(fā)灶和腹膜轉(zhuǎn)移灶Runx3mRNA表達較正常胃黏膜明顯下調(diào)，尤以腹膜轉(zhuǎn)移灶下降程度最著。將轉(zhuǎn)染外源性Runx3的胃癌細胞系注入裸鼠腹腔，結(jié)果轉(zhuǎn)染組腹腔內(nèi)極少有種植結(jié)節(jié)，而無轉(zhuǎn)染對照組動物腹腔內(nèi)有大量的、明顯的種植結(jié)節(jié)形成。因此認為Runx3基因的失表達與胃癌的腹膜轉(zhuǎn)移發(fā)生有關。Wei等［12］揭示胃癌組織中Runx3表達水平與患者的生存期密切相關。Peng等［13］通過對120例胃癌組織中Runx3表達與血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）表達的相關分析，揭示Runx3的轉(zhuǎn)錄可能與胃癌組織中VEGF的表達下調(diào)有關。因此Runx3基因沉默可能會加速胃癌的生長和遠處轉(zhuǎn)移。
2.4Runx3抑癌機制Runt區(qū)域轉(zhuǎn)錄因子與TGF-β超家族成員共同介導一些重要的生物學效應。TGF-β與其跨膜受體Ⅰ和Ⅱ（TβRⅠ和TβRⅡ）結(jié)合，產(chǎn)生受體異四聚體復合物（TβRC），從而發(fā)揮細胞內(nèi)生物效應［14］，此過程中Smad蛋白起重要的作用。TGF-β信號轉(zhuǎn)導通路的配體、受體和胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導分子Smad蛋白共同組成一個抑制腫瘤信號的通路。通路異常即可引起信號紊亂，促進多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展［15］。Runx3蛋白是TGF-β信號通路下游的一個轉(zhuǎn)錄因子，Runx蛋白與DNA結(jié)合，在TGF-β/BMP（bonemorphogeneticprotein）信號傳導中起重要作用。只有在Runx蛋白的參與下，Smad復合物才能從細胞質(zhì)內(nèi)轉(zhuǎn)入核內(nèi)的功能靶點，與Runx蛋白共同轉(zhuǎn)錄激活靶基因，從而對細胞的分化、周期調(diào)控、凋亡和惡性轉(zhuǎn)化起作用［16］。當Runx基因表達受抑制時，影響TGF-β信號通路的轉(zhuǎn)導，從而誘導腫瘤的發(fā)生。
Chi等［17］研究顯示Runx3是p21基因的下游調(diào)控子，p21在細胞生長周期中有重要作用，其通過抑制周期素依賴性蛋白激酶（cyclin-dependentKinase，CDK）表達而使細胞周期停滯于G1期。p21啟動子包括5個Runx結(jié)合位點，即3個完全匹配的a、b、c位點和2個部分匹配的d、e位點，當Runx結(jié)合域突變時，p21啟動子的活性明顯降低，而Runx3和Smad3協(xié)同表達時p21啟動子被激活，從而使細胞對TGF-β反應增強。Runx3的抑癌活性與其誘導p21表達的能力相關，p53也是通過調(diào)控p21表達活性來調(diào)節(jié)細胞生長周期，故兩者作用機制類似，但作用的信號通路不同。最近有研究顯示恢復Runx3表達可導致cyclinD表達下調(diào)，相反p27和caspase3、7和8則表達上調(diào)。這可能是Runx3誘導凋亡的潛在機制［14］。
因此，Runx3抑癌機制主要通過TGF-β信號通路協(xié)同Smad蛋白激活p21調(diào)節(jié)細胞生長周期，并通過下調(diào)cyclinD表達和上調(diào)p27和caspase3、7和8的表達而誘導凋亡。
3胃癌中Runx3基因表達降低或缺失的機制
3.1Runx3基因突變與表達基因突變是抑癌基因沉默的主要機制之一，然而文獻報道突變不是Runx3表達下調(diào)的主要機制［1，12，18］。
3.2Runx3基因雜合性缺失與表達Li等［1］應用熒光原位雜交技術(shù)（FISH）對15個胃癌細胞系和46例胃癌組織Runx3DNA倍體進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)20%的胃癌細胞系和30%的胃癌組織中的Runx3為異倍體。并采用RT-PCR方法和原位雜交方法分別對這些發(fā)生雜合缺失胃癌細胞系和胃癌組織標本進行Runx3mRNA表達的檢測，發(fā)現(xiàn)除1例胃癌組織可以檢測到Runx3mRNA表達外，其余均無Runx3mRNA表達。22例Ⅰ期胃癌中有3例Runx3存在雜合缺失，2例Ⅱ期胃癌沒有發(fā)現(xiàn)雜合缺失，14例Ⅲ期胃癌中3例Runx3存在雜合缺失，8例Ⅳ期胃癌中Runx3全都發(fā)生雜合缺失變化，說明Runx3的雜合缺失是胃癌中Runx3失活的原因之一，并且Runx3的雜合缺失和胃癌的分期有關。
3.3Runx3甲基化是胃癌中Runx3表達下調(diào)的主要原因啟動子異常甲基化在基因表達調(diào)控、DNA修復、基因穩(wěn)定及基因抑制方面起重要作用。Runx3啟動子P2區(qū)域有一個典型CpG島，理論上說明DNA甲基化可調(diào)控P2的轉(zhuǎn)錄。
Li等［1］揭示Runx3低表達或失表達都與Runx3啟動子P2區(qū)域CpG島過甲基化有關。Guo等［10］用N2甲基2N2亞硝基脲誘導鼠胃癌，從中建立4株胃癌細胞系，結(jié)果僅一株細胞系有微量的Runx3mRNA表達，其他3株細胞系均無Runx3mRNA表達，這3株Runx3基因沉默細胞系在Runx3啟動子區(qū)域亦存在明顯甲基化，所有細胞系經(jīng)過DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑52氮唑22脫氧胞苷（deoxycytidine，AZA）、組蛋白去乙酰酶抑制劑曲古抑菌素（trichostatin，TSA）共同處理后均恢復了Runx3表達。Waki等［19］檢測了10株胃癌細胞系、93例胃癌組織及相應正常胃黏膜組織Runx3基因啟動子甲基化狀態(tài)，結(jié)果7株胃癌細胞系、42例胃癌組織和7例正常胃黏膜組織存在甲基化。此外，對19例尸檢的正常胃黏膜組織Runx3甲基化狀態(tài)進行檢測，其中3例存在甲基化，但年齡均≥77歲，提示除高齡患者外Runx3甲基化幾乎是癌特異性的。Kim等［20］對75例胃癌和各種胃癌前期病變組織（胃腺瘤77例、慢性胃炎伴腸上皮化生32例和慢性胃炎不伴腸上皮化生99例）Runx3甲基化狀態(tài)進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在胃癌組織中Runx3甲基化發(fā)生率為64%，而在各種胃癌前期病變組織中也存在不同程度的Runx3甲基化，其中胃腺瘤27.3%、慢性胃炎伴腸上皮化生28.1%和慢性胃炎不伴腸上皮化生8.1%。而在有腹膜轉(zhuǎn)移的胃癌標本100%發(fā)現(xiàn)Runx3甲基化［11］。因此認為Runx3甲基化發(fā)生隨癌前期病變向癌的方向發(fā)展而增加，從原位癌到進展期胃癌Runx3甲基化率隨之升高，說明Runx3甲基化從胃癌的發(fā)生到胃癌的發(fā)展都有很重要的意義。Homma等［21］發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)胃癌細胞系（90%）、胃癌組織（96%）和配對的正常胃黏膜組織（96%）均存在Runx3基因5′端CpG島的甲基化，而在被視為導致基因沉默的關鍵部位——轉(zhuǎn)錄起始點附近區(qū)域的甲基化發(fā)生率較低，分別為40%、53%和11%。因此認為，Runx3基因高甲基化起初發(fā)生在5′端CpG島，進而向轉(zhuǎn)錄起始點區(qū)域擴展，最終導致Runx3mRNA失表達，Runx3基因CpG島多區(qū)域甲基化狀態(tài)檢測對胃癌的診斷及風險評估具有重要意義。
4小結(jié)
Runx3作為一個新發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，在調(diào)控細胞生長、發(fā)育、凋亡和以細胞的信號傳導及其他生物學效應方面有著重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用。其啟動子P2區(qū)域CpG島的過甲基化和雜合缺失是Runx3基因沉默的主要機制。Runx3的轉(zhuǎn)錄失活或表達下調(diào)可致胃黏膜上皮細胞的過度增生和分化異常，進而參與胃癌的發(fā)生和發(fā)展過程。Runx3有望成為一個惡性腫瘤，特別是胃癌發(fā)生發(fā)展的生物學標記物和腫瘤基因治療的靶點（如Runx3基因的導入、逆轉(zhuǎn)甲基化治療等），有可能為胃癌等惡性腫瘤的診療提供新的策略和方案。
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【關鍵詞】高中；生物；生活；方式；學生
生物課程與現(xiàn)實生活具有不可分割的關系，使高中生物課堂回歸現(xiàn)實生活，為提升課堂教學有效性開辟全新路徑。當前階段高中生物課堂回歸生活的方式已經(jīng)成為現(xiàn)階段教師群體廣泛熱議的話題。
一、知識導入側(cè)重強調(diào)生活性
新知識的導入環(huán)節(jié)直接決定著以后的學習效果，為了有效構(gòu)建生活化高中生物課堂，教師需要在設計導入環(huán)節(jié)時，緊緊圍繞生活性要求，有意識的引導學生分析生物知識，深化學生生物知識源于現(xiàn)實生活的觀念，生物知識是無法脫離生活獨立存在的。在實際設計生活化教學活動時，需要積極創(chuàng)設生動風趣的教學情景，引導學生借助實踐操作由原本的感性認知上升至理性層面，這也就需要將生活中較為熟悉的情景或物質(zhì)作為切入點，更容易被學生所接受理解?，F(xiàn)階段高中生已經(jīng)具備了獨立的學習思維，在設計教學內(nèi)容過程中，教需要充分考慮學生的學習情況，在新課導入環(huán)節(jié)側(cè)重引入生活實例，積極創(chuàng)設多元化生活情境，激發(fā)學生的學習興趣，調(diào)動學生的學習興趣，進而有效加深學生的學習印象[1]。
如：教師在教學人教版高中生物人教版必修二《人類遺傳病》這一課時，教師需要在上課時戴著口罩走到教室，并提出問題：“最近我晚上睡覺有些著涼感冒了，所以我要帶著口罩為你們講課，那么感冒發(fā)熱是不是遺傳?。繛槭裁?？”引導學生翻閱教材尋找問題答案如：遺傳病是由于人的生殖細胞或受精卵里遺傳物質(zhì)發(fā)生改變而引起的人類遺傳性疾病，而感冒發(fā)熱是由感冒病原體引起的傳染病，兩者有著根本的區(qū)別。在學生具備一定基礎上，要求學生以小組為整體討論“什么是健康的孩子？怎樣才能做到優(yōu)生”的問題，以此來幫助學生了解人類基因組計劃的基本內(nèi)容、正負面影響，知道基因診斷、基因治療的基本知識。
除此之外，教師也可以創(chuàng)設形式各異的生活化的情境，以此來不斷刺激學生的學習情緒。在實際教學過程中，教師需要側(cè)重引導學生分析現(xiàn)實生活中熱點問題，運用熱門話題來激發(fā)學生的求知欲。如：在講到關于DNA的知識時，教師則可以利用近期討論比較激烈的埃博拉病毒為引線，創(chuàng)設生物知識學習情境，將新聞信息與生物理論基礎進行結(jié)合，可以有效樹立學生關心國家關愛社會的意識，進一步引導學生自主參與到知識探究中。
二、不斷密切生物課堂與現(xiàn)實生活間的關系
在實際開展生物課堂教學活動時，教師可以采取聯(lián)想推理的形式激發(fā)學生的生活經(jīng)驗，引導學生分析閱讀教材給出的案例，以此來有效調(diào)動學生的學習思維，加深學生的情感體驗，使學生自主感受到生物知識的奧妙，進而有效提升學生的審美能力。同時，教師在開展教學活動時，需要盡可能聯(lián)系學生的現(xiàn)實生活，采用聯(lián)想法、敘述法、問題法等多種形式來構(gòu)建生活化教學情景，使學生可以結(jié)合自己的想法闡述生物知識[2]。
除此之外，教師還需要深入分析教材內(nèi)容，以教材內(nèi)容為切入點尋找與學生現(xiàn)實生活相關的生物知識，利用全新信息技術(shù)進行教學，使學生深刻感受到生物課堂教學活動不再是獨立存在的個體，而是與自我現(xiàn)實生活具有密不可分的關系，屬于生活中不可缺少的一部分。為了有效開展學生的學習視野，還需要及時掙脫教育與社會間的阻礙，將社會中多元化教學資源及家庭教育資源進行合理引入，以此來滿足學生不同的學習需求。借助此種多管齊下的教育策略可以將生物知識有效滲透至現(xiàn)實生活中，此教學活動也更加具備吸引力，進而從根本上提升了課堂教學的質(zhì)量。
三、實踐操作過程中強調(diào)生活化特性
生物實驗作為課堂教學活動中關鍵內(nèi)容，教師可以利用實驗操作幫助學生解析生物知識的奧秘，為學生提供操作的機會與平臺，使學生自主參與知識探究活動中，以此來有效強化學生的學習能力[3]。如：教師在教學人教版高中生物人教版必修一《能量之源-光與光合作用》這一課時，教師可以利用班級內(nèi)中綠植栽種的形式幫助學生理解生物知識，并提出如下問題：
（1）根據(jù)所學的化學知識可知，水和二氧化碳反應，應該生成什么產(chǎn)物？
（2）為什么在植物光合作用的過程中產(chǎn)物不是碳酸而是有機物？這說明光合作用過程中水和二氧化碳是否直接反應？
（3）光合作用的過程究竟是怎樣的？其全過程分為幾個階段？各階段的變化情況如何？
利用問題使學生借助實驗操作來求解實驗結(jié)論，不僅可以使學生對植物光合作用產(chǎn)生一個更為深刻的學習印象，也可以使學生理解運用自我所學知識也是可以解決現(xiàn)實問題的，有效樹立學生的學習信心，提升學生學習能力的基礎上，提升了課堂教學質(zhì)量。
結(jié)束語
綜上所述，在學生現(xiàn)實生活中可以接觸到許多形式各異的生物現(xiàn)象，若是將高中生物課堂回歸至生活中，不僅可以擴寬學生的學習視野，也充分激發(fā)了學生去探究生物知識的興趣，解決了傳統(tǒng)課堂教學活動存在的漏洞，從根本上推動了高中生物教育工作健康發(fā)展。
作者簡介：張旭陽，男，黑龍江省雞西市人，民族漢，職稱：中學二級，學歷：本科。
參考文獻：
[1]方應錢.高中生物生活化教學策略研究[J].當代教研論叢，2016，（11）：63+65.
【關鍵詞】 軟骨組織工程種子細胞源
多種原因造成的關節(jié)軟骨病變比較常見，軟骨損傷后缺乏自愈能力，軟骨缺損的修復一直是臨床的難題。隨著細胞生物學和材料科學的迅速發(fā)展，應用組織工程學技術(shù)修復軟骨病損已成為可能，而優(yōu)化種子細胞源是應用這一技術(shù)的前提和關鍵［1］。本文就有關軟骨組織工程種子細胞源的優(yōu)化獲取、存在的問題及其解決等研究進展作一綜述。
1 軟骨組織工程對種子細胞源的要求
組織工程軟骨的種子細胞應符合下列要求：來源豐富，取材方便；有較強的增殖傳代能力；與載體材料接種后能保持增殖能力和較高的黏附率，植入受區(qū)后能保持修復組織的表型；對機體或供區(qū)損傷小，臨床應用的生物安全性和無明顯的免疫排斥和其他潛在危險［2］。
2 軟骨組織工程的種子細胞源
2.1 自體軟骨細胞
理論上講自體軟骨細胞是軟骨組織工程最理想的種子細胞源，不僅功能相同，不存在免疫排斥反應，而且不需要誘導分化培養(yǎng)。但研究表明種子細胞濃度為(5～6)×107/ml時，形成的新生軟骨形態(tài)最佳，但是自體軟骨組織取材受限，軟骨細胞增殖能力低，難以達到應有的細胞數(shù)量，體外培養(yǎng)擴增容易發(fā)生去分化而失去原有的表型［3］，因此直接源于自體軟骨組織的種子細胞，體外單層培養(yǎng)難以獲取大量的細胞以滿足組織工程對種子細胞的需求。
為解決上述難題，使用生物反應器三維培養(yǎng)可使軟骨細胞快速擴增，建立能夠長期培養(yǎng)、表型穩(wěn)定的永生化軟骨細胞。生物反應器能控制pH、機械能力、營養(yǎng)供給條件等，為細胞的生長、分化提供最適宜的環(huán)境。根據(jù)自體軟骨細胞培養(yǎng)所需的條件，仿生性地設計接近體內(nèi)環(huán)境的軟骨生物反應器，模擬了體內(nèi)的細胞外基質(zhì)微環(huán)境。相同容積的生物反應器比普通培養(yǎng)方式，多出數(shù)10倍甚至上100倍的細胞?？蓽p少細胞去分化現(xiàn)象，有利于細胞表型的維持，提高種子細胞的質(zhì)量。有利于軟骨細胞的培養(yǎng)、擴增及表型維持。
2.2 同種異體軟骨細胞
與體內(nèi)其他組織相比，軟骨有其獨特的結(jié)構(gòu)和免疫學特點。軟骨無血管、淋巴管和神經(jīng)，細胞包埋在由軟骨基質(zhì)形成的軟骨囊內(nèi)，可阻擋免疫細胞直接與其接觸，不易被機體免疫系統(tǒng)攻擊，軟骨基質(zhì)抗原性低，一般不引起或僅有輕微的免疫反應，獲取種子細胞時要經(jīng)過消化分離和體外培養(yǎng)等一系列處理，軟骨細胞表面抗原可被進一步消弱。同種異體軟骨來源廣，易獲取，一次可獲取大量軟骨細胞，所以同種異體軟骨是值得研究的種子細胞來源［5］。應用同種異體軟骨細胞作種子細胞，在具有免疫力動物體內(nèi)形成同種異體工程化軟骨，并用于軟骨缺損修復的實驗報道，未發(fā)現(xiàn)明顯的免疫排斥反應［6］。研究表明胚胎來源的軟骨細胞較成體軟骨細胞引起的異體排斥反應微弱，提示在同種異體軟骨組織工程中，胚胎來源的軟骨細胞作為種子細胞是最佳選擇［7］。對同種異體軟骨細胞生物學特性和相關免疫反應問題的進一步研究，將為建立軟骨組織工程種子細胞庫奠定基礎。
2.3 骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrowderived mesenchymal stem cells，BMSCs)
骨髓中存在具有向多種細胞系分化潛能的BMSCs。Friedenstein發(fā)現(xiàn)骨髓中存在少量可以貼壁繁殖的BMSCs，條件培養(yǎng)液誘導可分化成為軟骨細胞。Cancedda等［8］對BMSCs和骨膜細胞修復兔股骨髁軟骨全層缺損進行了比較，發(fā)現(xiàn)兩者均能形成軟骨和軟骨下骨。
ButnariuEphrat等［9］用BMSCs復合聚合物支架，自體和異體移植修復股骨負重區(qū)軟骨缺損，結(jié)果自體BMSCs早期形成類透明軟骨，異體BMSCs的免疫反應導致后期纖維化和骨關節(jié)炎改變。Gao等［10］分別用成骨和成軟骨條件培養(yǎng)液誘導培養(yǎng)大鼠BMSCs，復合不同材料的雙層支架植入裸鼠背部皮下，術(shù)后1周檢測新生組織中含有Ⅰ、Ⅱ型膠原，認為BMSCs在不同生物活性因子的作用下，結(jié)合相應的生物材料可以構(gòu)建出工程化的骨軟骨復合體，因此，目前認為BMSCs是一種比較理想的種子細胞源。盡管BMSCs只有較強的增殖能力和多向分化潛能性，但其數(shù)量在全骨髓中僅占1／105～1/104，并且隨傳代次數(shù)的增加，其軟骨分化潛能逐漸降低，必須通過適當?shù)目刂茥l件和誘導因素，使BMSCs保持增殖并分化為軟骨細胞，也有研究表明重癥骨關節(jié)炎病人BMSCs的成軟骨能力明顯降低［11］，并且最近研究證實當BMSCs培養(yǎng)傳代90次后細胞發(fā)生癌變，聲稱這符合腫瘤細胞源于干細胞的假說，因此對BMSCs應用的生物安全性必須引起高度重視和深入研究［12］。
2.4 BMSCs與軟骨細胞共培養(yǎng)
基于BMSCs和軟骨細胞均不能完全滿足組織工程對種子細胞的要求，那么將2種細胞優(yōu)勢互補，進行共培養(yǎng)來優(yōu)化和擴大軟骨組織工程的種子細胞源就成為可供選擇的方式。Tsuchiya等［13］用不同比例的人BMSCs和牛軟骨細胞共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，BMSCs數(shù)量比例愈高軟骨細胞表達的Ⅱ型膠原和糖胺多糖愈高，并且能保持共培養(yǎng)前的細胞比例，因此BMSCs能促進軟骨細胞的增殖和基質(zhì)形成，其原因是共培養(yǎng)系統(tǒng)中BMSCs分泌的活性生長因子(TGF)，通過軟骨細胞介導自分泌或旁分泌上調(diào)了軟骨細胞基質(zhì)的合成。Goldberg等［14］用添加TGF β的培養(yǎng)基培養(yǎng)去分化的軟骨細胞，結(jié)果表明添加TGFβ能使去分化的軟骨細胞重新分化，從而維持了軟骨細胞的表型。在構(gòu)建工程化軟骨組織中，利用BMSCs增殖能力強的特點，少量軟骨細胞的微環(huán)境能誘導BMSCs分化為軟骨細胞，比單純軟骨細胞構(gòu)建的軟骨組織更為成熟，也避免了軟骨細胞長期培養(yǎng)傳代而導致的老化和去分化，并且節(jié)省了軟骨細胞的用量。因此BMSCs和軟骨細胞共培養(yǎng)對優(yōu)化和擴大種子細胞源可能是一種實用的策略。
2.5 軟骨膜細胞或骨膜細胞
骨膜和軟骨膜生發(fā)層含未分化的間充質(zhì)細胞，在低氧張力、無血供的關節(jié)腔內(nèi)分化為軟骨細胞、關節(jié)滑液和使用CPM是促使間充質(zhì)細胞向軟骨細胞分化的有利因素。Wakitani等［15］培養(yǎng)兔脛骨膜細胞，修復兔股骨髁全層軟骨缺損，24周時軟骨下骨完全形成，新生軟骨組織無骨化現(xiàn)象。Chu等［16］用異體肋軟骨膜細胞和PLA支架修復兔股骨髁軟骨缺損，96％的缺損6周時為軟骨填充，Ⅱ型膠原比例隨時間延長而升高，說明關節(jié)內(nèi)環(huán)境刺激新生組織向透明軟骨方向發(fā)展，黏多糖含量12個月時降低，軟骨下骨厚度為正常的50％，認為異體移植的免疫反應和PLA降解產(chǎn)物的酸性環(huán)境影響了軟骨下骨結(jié)構(gòu)的形成，導致新生軟骨生物力學性能下降和纖維化。
2.6 肌肉源性基質(zhì)干細胞(musclederived stromal cells)
Pate等［17］使用凍融方法和地塞米松誘導培養(yǎng)兔肌源性基質(zhì)干細胞，形成了軟骨結(jié)節(jié)和含有硫酸黏多糖的細胞外基質(zhì)。青年和老年人的肌細胞經(jīng)誘導培養(yǎng)出現(xiàn)同樣的結(jié)果［18］。Adachi等［19］用關節(jié)軟骨細胞或肌源性干細胞復合II型膠原凝膠修復兔股骨髁軟骨缺損區(qū)，24周后可見缺損區(qū)呈軟骨樣修復，優(yōu)于不含細胞的I型膠原凝膠對照組，認為肌源性干細胞取材方便，細胞倍增時間短，可以作為修復軟骨損傷的種子細胞源和基因治療的靶細胞。
2.7 脂肪源性基質(zhì)干細胞(adipose tissuederived stromal cells，ADSC)
為提供更多間充質(zhì)細胞的自體組織，Erickson等［20］用Ⅰ型膠原酶消化人吸脂術(shù)中的皮下脂肪，經(jīng)梯度密度離心獲取基質(zhì)干細胞，使用普通和軟骨誘導培養(yǎng)液(含TGFβ1和地塞米松)三維培養(yǎng)2周后植入裸鼠背部皮下4～12周取材，免疫組織化學和RTPCR檢測表明：軟骨誘導培養(yǎng)液體外培養(yǎng)1周和植入裸鼠體內(nèi)的標本均有明確的成軟骨特征，而使用普通培養(yǎng)液的對照組則陰性，類似結(jié)果亦見于大鼠脂肪來源的干細胞［21］。源于脂肪組織的基質(zhì)干細胞，因脂肪組織在體內(nèi)廣泛存在，取材方便，對人體造成的創(chuàng)傷相對較小，是目前獲取種子細胞的新途徑，也是研究的熱點，其細胞表型與BMSCs非常相似，均表達CD29、CD44、CD90、CD105，且缺少HLADR及Ckit表型，同時其增殖能力優(yōu)于BMSCs［22］。然而Hui等［23］在修復軟骨缺損的研究發(fā)現(xiàn)，在相同的實驗條件下其修復效果不如BMSCs。由于該細胞為誘導性干細胞，體外培養(yǎng)時必須在持續(xù)誘導條件下才能分化為軟骨細胞，培養(yǎng)難度相對較大并且其成軟骨機制尚不完全清楚。如能掌握脂肪組織基質(zhì)干細胞的成軟骨機制和性能，在體外培養(yǎng)持續(xù)向軟骨細胞分化，則不失為一種優(yōu)秀的種子細胞源［24］。
2.8 胚胎干細胞(embryonic stem cell，ESC)
胚胎干細胞來自早期胚胎的內(nèi)細胞團或尿生殖嵴，胚胎干細胞是全能干細胞，可分化為3個胚層的細胞，種植于體內(nèi)可形成包含三胚層細胞的畸胎瘤。改變體外培養(yǎng)條件，可使胚胎干細胞向不同的細胞系分化，文獻報道胚胎干細胞在BMP2和BMP4的作用下可分化為軟骨細胞［25］，胚胎干細胞與已分化的成熟軟骨細胞相比，除具有更強的增殖能力外，還具有再生潛能，可維持整個生命過程中細胞的更新和正常的功能，因而胚胎干細胞作為種子細胞可能更為優(yōu)勢。但使用胚胎干細胞作為組織工程的種子細胞，體外培養(yǎng)要求嚴格，自發(fā)分化難以控制，分化多具致瘤性，安全性難于把握，臨床使用尚存在倫理學問題。
3 基因修飾的種子細胞
多種細胞因子有促進軟骨修復的作用。通過基因重組技術(shù)，將細胞因子基因?qū)胲浌羌毎蛳嚓P細胞，使之在病損部位分泌生長因子并維持所需的濃度和時間，有效促進軟骨的修復，這就是基因修飾的組織工程技術(shù)(gene modified technology)。如TGF、IGF、EGF、GF等均可刺激軟骨細胞增殖和Ⅱ型膠原與蛋白多糖的合成。綠色熒光蛋白基因轉(zhuǎn)染軟骨細胞可標記軟骨細胞的示蹤。研究表明，在骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2和BMP-4的調(diào)控下，可在體外誘導ES細胞向軟骨細胞分化，同時保留其分泌Ⅱ型膠原等的特性。Sellers等［26］用含rhBMP2的I型膠原海綿修復兔膝關節(jié)軟骨缺損，24周時新生軟骨厚度達到正常軟骨的70％和潮線形成，rhBMP2組與單純膠原海綿和曠置組間的差異只有統(tǒng)計學意義，但是外源性生長因子半衰期短，需較大劑量或連續(xù)給藥才能發(fā)揮作用，增加了治療成本。Baragi等［27］以腺病毒攜帶lacZ作為報告基因，人白介素-1受體拮抗物(hIL-1ra)cDNA作為治療基因，用骨關節(jié)炎軟骨標本體外培養(yǎng)軟骨細胞和小軟骨薄片，結(jié)果表明轉(zhuǎn)染hIL-1ra基因可抑制IL-1引起的軟骨基質(zhì)變性，認為基因修飾后的軟骨細胞表現(xiàn)出更強的生物學功能，在一定程度上彌補了自體軟骨細胞供量不足的缺陷，縮短體外培養(yǎng)時間，更好地維持其表型。
多項研究表明以腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或脂質(zhì)體等作為載體，轉(zhuǎn)染軟骨細胞、骨膜細胞或直接注入病變部位是可行的，基因工程技術(shù)應用于組織工程領域可以使轉(zhuǎn)染的細胞持續(xù)、穩(wěn)定表達促進軟骨修復的生長因子，但病毒類載體潛在的致畸性、免疫源性以及脂質(zhì)體對種子細胞的毒性和轉(zhuǎn)染率低等尚需進一步改進。
4 展望
種子細胞是構(gòu)建組織工程化軟骨和應用研究中的首要環(huán)節(jié)和基本要求，也是保證軟骨組織工程學持續(xù)性深入研究的前提。影響優(yōu)化軟骨種子細胞源的因素眾多，目前研究的種子細胞各具優(yōu)缺點，尚沒有一種細胞能夠完全滿足軟骨組織工程對種子細胞的要求，今后需要開發(fā)和挖掘更多的種子細胞源，并在模擬體內(nèi)的微環(huán)境中進行培養(yǎng)，建立種子細胞的評價系統(tǒng)，優(yōu)化出理想的種子細胞，為軟骨組織工程的研究和臨床應用提供可靠保證。BMSCs相關研究和技術(shù)比較成熟，今后的研究重點是如何保證細胞能在特定的時間內(nèi)定向擴增到臨床治療所需的數(shù)量，并避免致瘤性的產(chǎn)生。BMSCs和軟骨細胞共培養(yǎng)可能為解決上述問題提供了一種實用的策略，但兩種細胞間的相互作用機制尚需進行深入研究。目前脂肪基質(zhì)細胞和胚胎干細胞的臨床應用研究相對滯后，但隨著科學技術(shù)的不斷發(fā)展，對其成軟骨機制和性能也會不斷了解，優(yōu)勢會逐漸顯現(xiàn)。當然，種子細胞的優(yōu)化只是軟骨組織工程學研究的第一步，今后還要解決細胞所需載體及細胞與載體相容性及相互作用等問題，當最終運用到臨床尚需考慮免疫排斥性問題。 參考文獻
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