發(fā)布時間：2023-06-07 15:35:09
序言：寫作是分享個人見解和探索未知領(lǐng)域的橋梁，我們?yōu)槟x了8篇的分子遺傳學(xué)綜述樣本，期待這些樣本能夠?yàn)槟峁┴S富的參考和啟發(fā)，請盡情閱讀。
【關(guān)鍵詞】釘螺；血吸蟲??；生物學(xué)特性；人工培養(yǎng)；綜述
【中圖分類號】R532．21【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A【文章編號】1673－5234（2015）12－1148－03
血吸蟲?。╯chistosomiasis）是一種嚴(yán)重的共患寄生蟲病，呈全球分布。在我國主要流行的是日本血吸蟲病。2013年全國共報(bào)告血吸蟲病感染184943例，晚期血吸蟲病患者29796例［1］，血吸蟲病的流行位居水傳播疾病之首，嚴(yán)重影響我國的社會經(jīng)濟(jì)發(fā)展和人類健康。釘螺（Oncomelaniahupensis）是日本血吸蟲的唯一中間宿主，主要分布在亞洲東部和東南部，中國內(nèi)地僅有湖北釘螺一種，釘螺分布與血吸蟲病的流行息息相關(guān)。目前防控該病最常用的方法是消滅釘螺，人工培養(yǎng)釘螺對研究釘螺的生物學(xué)特性和篩選滅螺藥物具有重要意義。本文對釘螺的生物學(xué)特性和人工培養(yǎng)的方法進(jìn)行綜述。
1釘螺的生物學(xué)特性
1．1形態(tài)學(xué)
釘螺為水陸兩棲，常棲息于田間、池藻等淡水水域。它主要由螺殼和軟體兩部分組成，軟體部分的前部為頭、頸、足和外套膜，后部是內(nèi)臟；表面有縱肋者稱“肋殼釘螺”，殼長約10mm，寬約4mm。殼面光滑者稱為“光殼釘螺”，比肋殼釘螺稍小，長、寬分別為6mm和3mm，多見于山丘地區(qū)。釘螺形態(tài)學(xué)特點(diǎn)主要包括形態(tài)特征、解剖結(jié)構(gòu)等方面。釘螺早期的研究重點(diǎn)集中在釘螺內(nèi)外部的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化，如螺殼形狀、螺肋的數(shù)目及厴核的旋數(shù)［2］，并以此來認(rèn)識與鑒別釘螺，如巴西釘螺被認(rèn)為是光殼釘螺的一種，螺殼黑色，螺殼外唇無隆起線，殼光滑有黃色“假眉”，厴與齒舌與湖北釘螺相同［3］。釘螺的形態(tài)特征是研究釘螺的分類、遺傳和進(jìn)化的基礎(chǔ)，分布于山區(qū)的光殼釘螺和分布于湖沼水網(wǎng)地區(qū)的肋殼釘螺生存條件不同。湖北釘螺具有遺傳多樣性，而且具有不同程度的遺傳變異［4］。石朝輝等［5］通過對湖北廟河上下游釘螺調(diào)查發(fā)現(xiàn)，兩個地區(qū)釘螺分別為光殼釘螺和肋殼釘螺，上下游螺群的遺傳距離并無明顯差異。
1．2分類學(xué)
釘螺俗稱釘螺螄，為動物界第二大動物門－軟體動物門腹足綱中的一類，有雌雄之分。早期對釘螺分類的研究主要是以釘螺形態(tài)學(xué)和解剖學(xué)為依據(jù)的，自1913年宮入慶之助和鈴木稔在日本證實(shí)光殼釘螺為日本血吸蟲的中間宿主以來，對釘螺分類的依據(jù)主要是根據(jù)形態(tài)和解剖結(jié)構(gòu)，如螺殼、螺厴和螺肋數(shù)目及齒舌形態(tài)特征。美國Bartsh根據(jù)螺旋數(shù)、齒式將釘螺分為Oncomelania、Katayama和Schistomophora［6］。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)螺殼顏色、螺厴、齒舌等差異不大，認(rèn)為釘螺的分類以形態(tài)結(jié)構(gòu)為依據(jù)并不嚴(yán)謹(jǐn)［7－8］。近年來分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展對釘螺分類的研究起到了重要作用。George等［9］通過對中國大陸不同地區(qū)、不同種群釘螺的同工酶進(jìn)行比較，再結(jié)合螺殼形態(tài)學(xué)的基礎(chǔ)將湖北釘螺再分成3個亞種：滇川亞種（O．h．robertsoni）、福建亞種（O．h．tangi）和湖北亞種（O．h．hupensis）。牛安歐等［10］利用單重復(fù)序列錨定PCR技術(shù)（SSR－PCR）將中國大陸7省的湖北釘螺分為4類。周藝彪等［11］采用微衛(wèi)星錨定PCR分子技術(shù)對19個種群釘螺的基因DNA進(jìn)行分析，進(jìn)一步驗(yàn)證了中國大陸湖北釘螺分為滇川亞種、廣西亞種、福建亞種和指名亞種等4個亞種。
1．3遺傳學(xué)
釘螺的生物特征、地理分布以及日本血吸蟲和釘螺之間的相容性都與釘螺遺傳學(xué)特性密切相關(guān)。表觀遺傳學(xué)、分子遺傳學(xué)和景觀遺傳學(xué)的研究應(yīng)用在生物滅螺中起著不可替代的作用。早期，表觀遺傳學(xué)常用來作為釘螺分類依據(jù)，劉月英等［12－13］認(rèn)為中國大陸釘螺屬于一屬一種，世界各地釘螺作為同一種屬只有種下亞種和地理株之分，但種下具體如何分類尚未得到解決。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，釘螺種群同工酶譜的分析、DNA基因序列的研究進(jìn)一步得到發(fā)展。日本血吸蟲與釘螺之間的相容性主要取決于兩者之間的同工酶等位基因［14］，而且不同種群的釘螺對日本血吸蟲的相容性不同［15］。周曉農(nóng)等［16］研究了中國9省34個地區(qū)螺群的同工酶，結(jié)果表明釘螺種群間的變異程度較大，而同種群內(nèi)的變異較小，肋殼釘螺的遺傳變異分化程度小于光殼釘螺，且釘螺從喜馬拉雅山脈擴(kuò)散至世界各地，因環(huán)境變化，基因也發(fā)生了劇烈漂移。景觀遺傳學(xué)是在2003年由Manel［17］首次提出，其結(jié)合了景觀生態(tài)學(xué)和種群遺傳學(xué)的特點(diǎn)，意義在于研究物種微進(jìn)化與景觀環(huán)境之間的關(guān)系，為研究釘螺遺傳變異分化提供了新的研究方法［18］。崔斌等［19］采用微衛(wèi)星錨定技術(shù)對湖北松滋地區(qū)不同景觀環(huán)境下釘螺遺傳特性進(jìn)行分析，結(jié)果表明湖北釘螺種群間遺傳變異并不明顯，而釘螺個體間變異顯著。景觀遺傳學(xué)作為一門新興學(xué)科，將人類及其活動納入了研究范疇，在理論和方法方面有很大的發(fā)展空間。
1．4生態(tài)學(xué)
釘螺繁殖、分布及擴(kuò)散等生態(tài)學(xué)特征與血吸蟲病的流行息息相關(guān)。釘螺生態(tài)學(xué)的研究對血吸蟲病的傳播和預(yù)防可以起到理論指導(dǎo)作用。釘螺的生長繁殖易受滅螺藥物和環(huán)境改變的影響，其分布密度與植被蓋度有關(guān)［20］。林丹丹等［21］對鄱陽湖的自然環(huán)境進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)植被總蓋度與釘螺分布成正比，總蓋度越高釘螺分布越廣。地形是影響釘螺分布重要的因素之一，楊慧等［22］對云南地形的考察，發(fā)現(xiàn)云南地形以山區(qū)為主，呈孤島性分布，擴(kuò)散不明顯，建議滅螺范圍應(yīng)以陽性釘螺分布地區(qū)為主，并適當(dāng)擴(kuò)大范圍。釘螺的擴(kuò)散方式主要以主動擴(kuò)散和被動擴(kuò)散為主，水流、光照強(qiáng)度、釘螺吸附能力以及水中障礙物均可影響釘螺的擴(kuò)散［23］。此外，自然因素和社會因素如水災(zāi)、水利工程建設(shè)及旅游開發(fā)等也可影響釘螺分布與擴(kuò)散。
1．5生理生化
釘螺的生理生化對研究滅螺藥物的作用機(jī)制以及滅螺效果具有重要意義。杜小華等［24］用不同濃度的水和乙醇提取物配置成不同濃度的羊躑躅溶液進(jìn)行滅殺釘螺實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示濃度不同的提取物處理釘螺后的滅殺率不同，其中以70％乙醇提取物滅殺釘螺的效果最佳。周康等［25］通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)瑞香狼毒同上述幾種藥物一樣對釘螺的主要能量代謝物質(zhì)糖原有較強(qiáng)的抑制作用，而且以濃度為70％乙醇提取物的效果最好。黃春蘭等［26］用硫酸、蒽酮比色法鑒定湖北釘螺各月份的肝、頭足部肌肉和整體軟體組織的糖原含量，結(jié)果表明整體軟體組織和肝的糖原含量隨著時間的推移而下降。吳明煜等［27］用不同濃度的蛇床子總香豆素處理液浸泡釘螺，在浸泡液處理的前96h內(nèi)，釘螺體內(nèi)糖原的含量隨著浸泡時間的延長而降低，說明蛇床子總香豆素可以影響釘螺的糖原含量。胡彥龍等［28］研究發(fā)現(xiàn)田皂角甙當(dāng)濃度超過0．80g／L時可以明顯降低釘螺體內(nèi)糖原含量，降低的幅度達(dá)12．49％～73．16％。劉金濤等［29］發(fā)現(xiàn)濃度大于0．85g／L的苦楝子可以降低釘螺內(nèi)的糖原含量，降低幅度為10．78％～69．94％。過氧化物酶、三磷酸腺苷酶、琥珀酸脫氫酶、乳酸脫氫酶是釘螺進(jìn)行有氧呼吸的關(guān)鍵酶，抑制這些酶的合成可以有效地殺滅釘螺。顧文彪等［30－31］用苦楝葉提取液浸泡釘螺發(fā)現(xiàn)三磷酸腺苷酶、琥珀酸脫氫酶和乳酸脫氫酶降低，而一氧化氮合成酶增高，一氧化氮合酶的升高可以使NO合成增加，破壞釘螺機(jī)體內(nèi)的線粒體氧化磷酸化，使能量合成受抑制，達(dá)到殺滅釘螺的效果。王萬賢等［32］分別采取樟樹的新鮮葉、莖皮和根皮調(diào)配成1％、0．5％、0．1％、0．05％等4個不同濃度的溶液處理釘螺，結(jié)果顯示釘螺體內(nèi)的過氧化物酶的活性隨著浸泡的時間延長活性降低，其中以根皮的效果最好，葉的效果較差，建議大量種植樟樹作為生態(tài)林可達(dá)到較好的抑螺效果。
2釘螺的人工培養(yǎng)研究
2．1釘螺螺卵的孵化和幼螺的生長
對于釘螺螺卵的孵化和幼螺的生長，主要的影響因素為溫度、水和食物。釘螺螺卵的正常孵化需要在水中或是濕潤的泥面上［33］，飼料以奶粉及復(fù)合動物飼料為主，其中藻類喂養(yǎng)幼螺存活率較高，達(dá)90％以上，且生長良好［34－35］。田建國等［36］采用了收集螺卵恒溫孵化法、直接恒溫孵化法和自然狀態(tài)孵化法三種方法對釘螺螺卵進(jìn)行孵化，結(jié)果顯示泥土也可以影響釘螺螺卵的孵化。
2．2成螺的人工培養(yǎng)
成螺培養(yǎng)因?qū)嶒?yàn)?zāi)康牟煌?，室?nèi)培養(yǎng)方法也不盡相同，常用室內(nèi)培養(yǎng)感染性釘螺是泥盤草紙飼養(yǎng)法［37］。成螺培養(yǎng)主要為感染性釘螺，其中毛蚴感染釘螺的比例至關(guān)重要，張聰?shù)龋?8］采用泥缽內(nèi)鋪細(xì)土泥法，按毛蚴與釘螺數(shù)量比為5：1、10：1、20：1三種不同比例進(jìn)行感染，結(jié)果顯示毛蚴感染的比例為10：1時，釘螺陽性感染率最高。
3結(jié)語
1.VT的臨床特點(diǎn)及診斷技術(shù)：VT常起始于脛靜脈或比目魚肌的肌內(nèi)靜脈竇，且往往多發(fā)，易脫落至靜脈，股靜脈及下腔靜脈內(nèi)，因多數(shù)栓子體積甚小，甚至脫落至肺動脈內(nèi)亦無任何臨床表現(xiàn)，而易被忽略，但如無防治則長期反復(fù)脫落栓塞至肺動脈，血栓機(jī)化后便形成慢性肺動脈栓塞，引起栓塞性肺動脈高壓、肺心病，治療棘手，預(yù)后較差。而在臨床上，常引起我們注意的是一些有明顯臨床表現(xiàn)的下肢深靜脈血栓栓塞，因其栓子較大，如連續(xù)幾塊栓子脫落栓塞于段以上的肺動脈則可引起致命性的臨件發(fā)生，至少可在短時間內(nèi)引起心肺功能惡化。但實(shí)際上前者發(fā)病率遠(yuǎn)高于后者。須指出很多患者雖因原發(fā)疾病而死亡，但慢性肺動脈栓塞常是使原發(fā)疾病難以糾正的重要原因。
臨床常用VT檢測手段包括下肢靜脈阻抗容積圖法、X線靜脈造影及同位素靜脈顯像等，但目前便攜式靜脈彩色超聲多譜勒儀因其方便、無創(chuàng)及靈敏度、特異性高而最受推崇，可應(yīng)用于人群普查，為研究VT單位的必備設(shè)備。
2.明確VT與PE的關(guān)系：必須強(qiáng)調(diào)，VT是PE發(fā)生的標(biāo)識。嚴(yán)格定義，PE是靜脈系統(tǒng)（含右心）血栓形成后，在環(huán)境因素作用下脫落并栓塞于肺動脈而引起一系列病理生理變化的臨床綜合征，所以靜脈血栓是PE的源頭，而控制VT是防治PE的根本所在。
為了進(jìn)一步闡明二者之間關(guān)系，國外已有通過尸檢而確認(rèn)PE栓子靜脈來源的研究，其中歐洲的一組研究結(jié)果為：單個栓子來源排序分別是下肢靜脈（52.7%）、盆腔靜脈叢（32.1%）、右心（13.7%）、上肢靜脈（1.5%）；多個栓子來源排序分別是下肢靜脈和盆腔靜脈叢（36.2%）、不同下肢靜脈組合（31.9%）、下肢靜脈和右心（10.6%）、盆腔靜脈叢和右心（10.6%）；19%來源不詳［1］。我國目前尚無此方面的報(bào)道，建議有條件的醫(yī)院可以聯(lián)合起來匯集尸檢資料，分析我國PE栓子的來源靜脈，對于國人PE防治有積極意義。
3.VT的危險(xiǎn)因素：目前公認(rèn)VT的危險(xiǎn)因素分為遺傳因素和環(huán)境因素兩部分。
環(huán)境因素包括：年齡＞40歲、長期臥床、腫瘤、胸腹盆腔下肢或骨科手術(shù)、肥胖、靜脈曲張、心力衰竭、心肌梗塞或腦卒中、糖尿病、骨折、炎癥性腸病、腎病綜合征、長期留置中心靜脈導(dǎo)管、口服避孕藥等［2，3］。
遺傳因素目前是研究VT的熱門領(lǐng)域，同樣骨折或手術(shù)后患者，臥床時間相同，有的患者發(fā)生PE而有的患者未發(fā)生，原因既在于此。目前認(rèn)為至少有12種基因參與，本文作者亦對此有較為詳細(xì)的綜述［4］。須著重強(qiáng)調(diào)的是活化的蛋白C抵抗即FVleiden，是目前最為肯定也是最常見的VT遺傳危險(xiǎn)因子，是V因子基因單點(diǎn)錯意突變，即其基因核甘酸序列中1691位鳥嘌呤被腺嘌呤替代，導(dǎo)致其氨基酸序列中第506位精氨酸被谷酰氨代替［5］。但其與國人VT的關(guān)系，尚不清楚。目前雖可見在國人VT患者血中檢測到FVleiden的報(bào)道，但僅一例，并不能說明其發(fā)生頻率。
4.國人VT研究現(xiàn)狀：目前我國匱乏大樣本、正規(guī)的VT及PE的流行病學(xué)資料。最近雖有幾組關(guān)于發(fā)病情況的報(bào)道也多是其醫(yī)院內(nèi)局域統(tǒng)計(jì)資料，對于人群防治價值有限。而血栓性疾病發(fā)病的地區(qū)、人種差異很大，不能完全引用國外的流行病學(xué)資料，尚有待我國國人資料的總結(jié)。令人鼓舞的是我院程顯聲教授領(lǐng)銜的“九五”攻關(guān)課題“肺栓塞的早期防治研究”已將VT的流行病學(xué)研究列為重要的分支課題，調(diào)查資料有望發(fā)表，將為國人VT的防治提供極為有價值的基線資料。
另外，國內(nèi)研究VT者多為血液科醫(yī)師與研究人員，規(guī)模較小，成果受限。因PE是一跨學(xué)科疾病，應(yīng)學(xué)習(xí)國外模式，聯(lián)合肺科、心臟科、血管外科、流行病學(xué)家、社區(qū)全科醫(yī)師等，形成正規(guī)研究團(tuán)體，才可能對國人VT與PE防治作出有意義的工作。
5.VT的預(yù)防措施：根據(jù)國外經(jīng)驗(yàn)，常用的VT預(yù)防措施有以下幾種：(1)目前推薦最有效的預(yù)防措施為在以上提到的高危人群中應(yīng)用低分子量肝素或普通肝素。有報(bào)道可使VT發(fā)生率由25%降為8%，使大塊PE發(fā)生率降低50%［6，7］。(2)間歇空氣加壓：在高?；颊叩南轮脷鈮盒鋷糠昼娂訅?5～40mmHg×10s(1mmHg=0.133kPa)，目前認(rèn)為可以減少靜脈血栓的形成［6］。(3)有人推薦使用彈性襪預(yù)防VT，但無流行病學(xué)資料證實(shí)其有效性。(4)右旋糖苷：其預(yù)防VT發(fā)生不如肝素有效，但可進(jìn)一步阻止VT的發(fā)展而減少PE［6，8］，其作用機(jī)制可能是阻止血栓進(jìn)一步增大和脫落［9］。(5)阿司匹林：曾有研究否認(rèn)了阿司匹林對VT的預(yù)防作用，但最近一項(xiàng)較大規(guī)模臨床試驗(yàn)證實(shí)其可使VT發(fā)生率較對照組減少37%，PE發(fā)生減少71%［10］。且阿司匹林使用方便，價格便宜，適合各級醫(yī)師包括初級保健醫(yī)師、農(nóng)村醫(yī)師使用。(6)華法令雖然有效，但監(jiān)測煩瑣，作用時間較難控制，不推薦常規(guī)使用。
6.VT預(yù)防工作尚未廣泛開展的原因：在美國，96%的外科醫(yī)師都同意在術(shù)中、術(shù)后廣泛使用各種措施預(yù)防VT［6］，而在國內(nèi)尚未廣泛開展，其原因有以下幾條：(1)誤以為發(fā)生率低；(2)恐懼出血的副作用；(3)擔(dān)憂醫(yī)療費(fèi)用增加（沒有計(jì)算治療PE的高額費(fèi)用）；(4)感知困難：出血令人難忘，抗凝的益處卻很難直接感知；(5)對發(fā)生的后果估計(jì)不足。這提示我們需要加強(qiáng)宣傳，提高全體醫(yī)師包括縣級基層醫(yī)院醫(yī)師防治VT的意識。
VT的研究與防治在我國是一項(xiàng)很重要的衛(wèi)生保健任務(wù)。總體來說，目前我國相關(guān)研究與國外相比，差距很大，僅有零星個案報(bào)道，急需組織一支由多學(xué)科研究人員共同組成的專業(yè)研究團(tuán)體，專門從事其臨床研究工作，爭取從分子遺傳學(xué)、遺傳流行病學(xué)、人群篩查技術(shù)、初級及二級預(yù)防措施的推廣等多方面有所突破，從而為總體降低PE的發(fā)生打下基礎(chǔ)。
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關(guān)鍵詞：妊娠高血壓疾病 發(fā)病學(xué) 研究進(jìn)展
中圖分類號：R711 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1004-7484（2012）10-0222-03
母親安全、兒童優(yōu)先是圍生醫(yī)學(xué)永恒的主題。該主題的初級目標(biāo)是降低孕產(chǎn)婦和圍生兒死亡率，中期目標(biāo)是降低母嬰發(fā)病率和殘疾率，終期目標(biāo)是提高人口素質(zhì)[1]。
妊娠期高血壓疾病的發(fā)病學(xué)及機(jī)制的不清目前仍然困擾著全球產(chǎn)科。由該病引起的孕產(chǎn)婦及圍生兒的死亡率和并發(fā)癥也一直威脅著女性健康。由于現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)方法的進(jìn)步，在研究過程中發(fā)現(xiàn)了很多與妊娠高血壓疾病的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的因子，從而建立了許多學(xué)說，本文從以下幾個方面來綜述：
1 發(fā)病學(xué)研究的概述
盡管妊娠高血壓疾病的病因研究已有100多年的歷史，通過無數(shù)學(xué)者不懈的努力但至今仍未很清楚的闡明。其病理生理學(xué)改變廣泛而復(fù)雜，包括全身血管痙攣、凝血系統(tǒng)的激活及止血機(jī)制異常，前列環(huán)素與血栓素比值的改變等。這些異常的改變導(dǎo)致多器官系統(tǒng)血管的病理損害（如腎、肝、心、腦及子宮胎盤血管床），結(jié)果可引起胎兒生長遲緩、死胎、早產(chǎn)、圍產(chǎn)期窒息，孕婦也容易并發(fā)胎盤早剝、抽搐、顱內(nèi)出血、肺水腫及肝腎功能衰竭等。近年來，隨著醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)理論特別是分子生物學(xué)的研究進(jìn)展，使妊娠高血壓疾病從發(fā)病學(xué)的研究到病理生理變化取得了新的突破。
2 發(fā)病學(xué)研究的機(jī)制與學(xué)說
2.1胎盤或滋養(yǎng)葉細(xì)胞缺血學(xué)說：
早在1918年，Young首先提出子宮缺血學(xué)說，其支持理由在于妊娠高血壓疾病多發(fā)生于：（1）子宮內(nèi)壓增高的患者；（2）合并有全身血管病變的孕婦；（3）先天性動脈發(fā)育畸形的患者。以后通過許多學(xué)者的實(shí)驗(yàn)證明，子宮—胎盤缺血學(xué)說獲得公認(rèn)。后來又從葡萄胎可并發(fā)妊娠高血壓疾病的現(xiàn)實(shí)得到啟示，胎盤缺血關(guān)鍵可能在于滋養(yǎng)葉細(xì)胞缺血。
滋養(yǎng)葉細(xì)胞缺血與早孕期子宮胎盤血管床發(fā)育受阻有關(guān)。提示早孕期滋養(yǎng)葉細(xì)胞缺氧，可能是導(dǎo)致子宮胎盤血管床發(fā)育受阻的重要原因。目前又稱這種病理現(xiàn)象為胎盤淺表著床或缺陷胎盤。
2.2高同型半胱氨酸血癥與血管內(nèi)皮損傷學(xué)說：
近年來，動物試驗(yàn)證實(shí)，高同型半胱氨酸血癥可誘發(fā)孕鼠產(chǎn)生妊娠期高血壓疾病的典型改變[2]。因此，目前高同型半胱氨酸是妊娠期高血壓疾病發(fā)病學(xué)研究的熱點(diǎn)。高同型半胱氨酸可能導(dǎo)致妊娠期高血壓疾病的機(jī)制：高同型半胱氨酸促進(jìn)氧自由基的生成，使氧化還原系統(tǒng)平衡失調(diào)，呈現(xiàn)氧化應(yīng)激狀態(tài)，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞受損，繼而引發(fā)小動脈痙攣等一系列病理生理改變，符合妊娠期高血壓疾病的發(fā)病機(jī)制[3]，動物試驗(yàn)通過給予蛋氨酸負(fù)荷至Wistar大鼠形成高同型半胱氨酸動物模型顯示，血漿一氧化氮濃度較試驗(yàn)前明顯降低，證實(shí)了高同型半胱氨酸血癥對血管內(nèi)皮功能的損害作用[4]。高濃度的同型半胱氨酸及其產(chǎn)生的過氧化物超過了細(xì)胞的清除能力，破環(huán)了細(xì)胞的防御性保護(hù)反應(yīng),導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損傷。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)高同型半胱氨酸血管內(nèi)皮損傷的特殊標(biāo)志物：血管內(nèi)皮損傷因子[5]，血管細(xì)胞粘附因子21，纖維結(jié)合素[6]，均生成增加[7]。研究還表明，早發(fā)型重度子癇前期患者血清同型半胱氨酸顯著高于晚發(fā)型重度子癇前期組及正常妊娠組[8]。所以，研究證明了高同型半胱氨酸在妊娠期高血壓疾病內(nèi)皮細(xì)胞損傷中起著很重要的作用。目前認(rèn)為，血管內(nèi)皮具有多種重要的生理功能。一旦血管內(nèi)皮受損可導(dǎo)致血管通透性增加，體液與旦白升高，抗凝血因子和血管擴(kuò)張因子減少，在受損部位引發(fā)促凝血因子合成和激活凝血系統(tǒng)，最終導(dǎo)致血小板凝聚及血栓形成并釋放有絲分裂元，其中主要的有血小板衍生生長因子，這是一種很強(qiáng)的血管收縮因子。因此，血管內(nèi)皮損傷是目前提出普遍公認(rèn)的妊娠高血壓疾病的主要發(fā)病機(jī)理。
2.3免疫學(xué)說：
從免疫學(xué)角度看來，胚胎是一半同種異體移植物，妊娠成功有賴于胎兒——母親間的免疫平衡，而這種平衡一旦失調(diào)，就可能引發(fā)排斥反應(yīng)，導(dǎo)致病理妊娠，如妊娠高血壓疾病。目前支持妊娠高血壓疾病與排斥反應(yīng)有關(guān)的證據(jù)主要是，患者子宮螺旋小動脈存在著類似于腎移植排斥反應(yīng)所出現(xiàn)的典型的血管炎病變，即螺旋小動脈急性粥樣硬化。這一點(diǎn)為過去和近年來國內(nèi)外研究反復(fù)證實(shí)。
2.4遺傳學(xué)說：
從臨床觀察，妊娠高血壓疾病存在著明顯的遺傳傾向，即有妊娠高血壓疾病家族史的孕婦，妊娠高血壓疾病發(fā)病率明顯高于無家族史的孕婦。
從分子學(xué)水平對本病進(jìn)行探討發(fā)現(xiàn)，采用血清學(xué)方法檢測，妊娠高血壓疾病患者白細(xì)胞抗原（HRA）DR4頻率明顯增高。PCR和地高辛標(biāo)記寡核苷酸探針雜交技術(shù)，探查H41—DRB1基因座位，也證實(shí)妊娠高血壓疾病HLA—DR4抗原頻率增高和母親、胎兒HLA—DR4抗原相容性增加有關(guān)，同時還發(fā)現(xiàn)等位基因0405基因頻率也明顯增加。這些表明，妊娠高血壓疾病至少與HLA—DR4相關(guān)。妊娠高血壓疾病分子遺傳學(xué)的研究，還有待深入。
關(guān)鍵詞 番木瓜；遺傳改良；研究進(jìn)展
番木瓜屬番木瓜科多年生常綠小喬木，是熱帶、亞熱帶地區(qū)廣泛栽培的熱帶名果之一，在我國約有70多年的栽培歷史。目前，番木瓜的種植模式、病害控制和種苗生產(chǎn)等問題仍是番木瓜種植和推廣的主要障礙。近50年來，離體培養(yǎng)、雜交育種、人工誘變育種、基因工程等現(xiàn)代遺傳育種學(xué)及生物技術(shù)的發(fā)展，為解決這些難題提供了新的途徑。筆者就生物技術(shù)及各育種手段在番木瓜研究中的應(yīng)用進(jìn)行綜述。
1番木瓜的離體培養(yǎng)
離體培養(yǎng)就是利用體細(xì)胞進(jìn)行無性繁殖的一種方法。在離體培養(yǎng)中外植體的選擇相當(dāng)廣泛，根、葉柄、莖段、子葉、胚珠、幼胚等都被相繼用來進(jìn)行不同目的的離體培養(yǎng)研究。目前，國外已經(jīng)有許多關(guān)于番木瓜離體繁殖體系、體細(xì)胞胚胎和器官發(fā)生、芽體繁殖、細(xì)胞原生質(zhì)體培養(yǎng)等方面的報(bào)道。例如早在1978年，Litz[1]等用花藥懸浮液體培養(yǎng)誘導(dǎo)番木瓜單倍體獲得了0.1%的再生頻率，證實(shí)利用花藥或花粉培養(yǎng)番木瓜單倍體是可行的。Fredah[2]等通過花藥培養(yǎng)誘導(dǎo)番木瓜胚的形成，結(jié)果發(fā)現(xiàn)花藥培養(yǎng)得到的番木瓜植株絕大部分是雌性株，可用以繁殖雌性的番木瓜。1974年，DeBruijne[3]等首次報(bào)道了以番木瓜的葉柄誘導(dǎo)形成愈傷組織，并產(chǎn)生了體細(xì)胞胚，但未報(bào)道體細(xì)胞胚是否培養(yǎng)出小植株。Litz等人在1977年[4]，用番木瓜的莖尖和葉柄在MS和White培養(yǎng)基上獲得了試管株系；1982年[5]，他們又從胚珠產(chǎn)生的愈傷組織誘導(dǎo)產(chǎn)生體細(xì)胞胚并獲得再生植株；1983年[6]，他們通過培養(yǎng)番木瓜胚珠獲得了大量體胚并長成苗。1987年[7-8]，Drew和Chen等也分別從根外植體誘導(dǎo)產(chǎn)生體細(xì)胞胚和再生植株。此外，F(xiàn)itch等[9-10]分別以幼胚、下胚軸為外植體誘導(dǎo)產(chǎn)生了體細(xì)胞胚，并實(shí)現(xiàn)了植株再生。
近年來，隨著組織培養(yǎng)技術(shù)的迅速發(fā)展及其與分子生物學(xué)各學(xué)科領(lǐng)域交叉結(jié)合的發(fā)展，國內(nèi)也有不少學(xué)者對番木瓜的離體培養(yǎng)進(jìn)行了研究。如葉克難等[11]以根、莖為外植體進(jìn)行懸浮培養(yǎng)后，獲得了大量體細(xì)胞胚產(chǎn)生的再生植株；朱西儒等[12]以葉為外植體誘導(dǎo)產(chǎn)生了胚性愈傷組織并獲得再生植株；曾繼吾等[13]以子葉和幼胚2種不同的外植體誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，結(jié)果2種來源的愈傷組織均能誘導(dǎo)成胚性愈傷組織并形成完整的植株，而且體細(xì)胞胚的發(fā)生率決定于外植體和培養(yǎng)基的激素成分。此外，鄒韻霞等[14]報(bào)道，在番木瓜受精胚珠誘導(dǎo)體細(xì)胞胚發(fā)生的過程中，NAA+BA+GA3組合誘導(dǎo)效果最佳，能獲得理想的胚性愈傷組織和體細(xì)胞胚。林治良等[15]和周鵬等[16-17]以番木瓜側(cè)芽作為外植體，分別在MS和BM培養(yǎng)基上建立了試管離體繁殖體系。蔡英卿等[18]報(bào)道了外植體、糖類、激素、有機(jī)物、光照等因素對番木瓜體胚誘導(dǎo)的影響。
2番木瓜的雜交育種
雜交育種是在各種糧食作物、經(jīng)濟(jì)作物、水果蔬菜等作物上應(yīng)用廣泛且取得了良好成效的常規(guī)育種手段之一。在番木瓜的雜交育種中，國內(nèi)外已選育出許多優(yōu)良的栽培品種[19]，如廣州市果樹研究所先后選育出穗中紅、美中紅、優(yōu)8等優(yōu)良品種[20]。但一直以來，番木瓜病毒病是限制番木瓜大面積種植和發(fā)展利用的最大因素之一，在已報(bào)道的近10種番木瓜病毒病中，番木瓜環(huán)斑?。≒RV）危害最嚴(yán)重。除了報(bào)道的少數(shù)抗PRV的雜交種和僅有的3種抗PRV的野生種（莖花番木瓜、托葉番木瓜和有毛山番木瓜）外，幾乎所有的番木瓜栽培品種都不能抵抗PRV的危害[21]。但由于這3種野生種不僅不能食用，而且與C.papaya存在不同程度的雜交不親和性，這無疑給番木瓜的雜交育種工作帶來了困難，難以很好地利用天然抗PRV的基因。
近年來，番木瓜實(shí)驗(yàn)胚胎學(xué)、酶學(xué)等研究的不斷發(fā)展，已有一些學(xué)者成功地獲得了一些有利的雜交品種。如夏威夷大學(xué)的Manshardt和Wenslaff[22]在雜交試驗(yàn)中，以3個C.papaya株系（Kapaho、Hawaii和Washington）和2個C.caulofora株系（UH345和UH372）為親本，全部組合的種間互交后，結(jié)果只有UH345為母本的組合能夠產(chǎn)生發(fā)育成熟的合子胚。Moore等[23]通過同工酶和PAGE檢測得到源于C.papaya×C.caulofora雜種胚性愈傷組織的體細(xì)胞植株，經(jīng)過分析其相應(yīng)的染色圖譜，確定該體細(xì)胞胚再生植株是種間雜種的后代。后來，Chen等[24]在實(shí)驗(yàn)中也證實(shí)了C.papaya×C.caulofora雜種胚的再生植株具有種間雜種的真實(shí)性。朱西儒等[25]在番木瓜雜交育種實(shí)驗(yàn)中獲得了2個較好的雜交組合，雜交后代的抗病性有所提高。黃建昌等[21]也通過輪回選擇方式，用多個組合進(jìn)行種內(nèi)雜交，獲得抗病性較強(qiáng)的雜交后代。
3番木瓜的基因工程育種
長期以來，番木瓜都面臨著病毒病的危害，尤其是PRV，但由于傳統(tǒng)防治方法有著諸多的缺陷，防治效果并不理想。利用基因工程進(jìn)行抗病品種的培育是防治和治理病毒病的根本途徑。目前番木瓜基因工程育種主要采取2種策略：一是直接分離克隆抗PRV基因，將之轉(zhuǎn)入番木瓜基因組中，使之獲得抗性；二是將PRV病毒外殼蛋白或核酸酶基因轉(zhuǎn)入番木瓜中，使之獲得抗性[26]。1990年，F(xiàn)itch等[9]建立了以番木瓜胚性愈傷組織為受體的共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體系，并通過體細(xì)胞胚發(fā)生獲得了2株表達(dá)HA5-1的轉(zhuǎn)基因植株，進(jìn)一步的繁殖擴(kuò)增成為2個品系。1992年，F(xiàn)itch等[27]用基因槍法把構(gòu)建在PG482GG的HA5-1CP的嵌合基因?qū)敕竟?，獲得5個轉(zhuǎn)基因品系，其中1個品系為高抗PRV株系，在田間種植2a都不發(fā)病。我國學(xué)者[28-29]通過酶聯(lián)吸附免疫、點(diǎn)雜交等分子遺傳學(xué)手段，也先后得到轉(zhuǎn)番木瓜環(huán)斑病毒外殼蛋白基因（PRAC-CP）植株及轉(zhuǎn)環(huán)斑病毒外殼蛋白基因和核酸酶基因（PRSV-CP-SN）植株。葉長明等[30-31]首次將PRV復(fù)制酶（RP）突變體基因?qū)敕竟汐@得轉(zhuǎn)基因抗病品系；隨后，葉長明等[32]通過對RP基因分析，證實(shí)了轉(zhuǎn)PRV RP基因番木瓜對PRV抗性達(dá)到高抗或免疫，RP基因可穩(wěn)定遺傳并在RNA水平上表達(dá)。Tennant等[33]發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因番木瓜Rainbow和Sunup都抗夏威夷品種PRSV的分離物。Chiang等[34]構(gòu)建了一系列重組PRSV來接種轉(zhuǎn)PRSV-CP基因的Rainbow，結(jié)果表明，要獲得抗PRSV不同株系的廣譜抗性的轉(zhuǎn)基因番木瓜，在構(gòu)建時應(yīng)包括CP基因的完整編碼區(qū)及3′非編碼區(qū)。此外，還有眾多學(xué)者也開展了番木瓜轉(zhuǎn)基因的研究[35-38]。
除了對番木瓜病毒病的轉(zhuǎn)基因研究外，還有一些學(xué)者利用分子生物學(xué)的方法對番木瓜進(jìn)行了性別的鑒定以及遺傳變異的研究。Sonsri等[39]用DNA擴(kuò)增指紋（DAF）技術(shù)對番木瓜性別基因標(biāo)記進(jìn)行了研究，雖然找到了多個性別相關(guān)的標(biāo)記，但未進(jìn)行遺傳連鎖分析。Sordur等[40]也曾用RAPD技術(shù)構(gòu)建了1個番木瓜遺傳連鎖圖譜，其中在性別決定座位兩邊各有1個標(biāo)記，但遺傳距離為7cm。周國輝等[41]應(yīng)用BSA法確立了2個與番木瓜兩性基因緊密連鎖的RAPD標(biāo)記，它們與兩性基因的遺傳距離分別為4.5cm和1.9cm，為番木瓜性別基因的精細(xì)定位和克隆打下了良好的基礎(chǔ)。陳中海等[42]在實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)用同工酶（POD、EST、PPO）、蛋白質(zhì)的SDS-PAGE以及RAPD標(biāo)記三方面研究番木瓜雌株、雄株和兩性株之間的差異，結(jié)果表明以上標(biāo)記均可較準(zhǔn)確地鑒別出番木瓜的雌、雄株，可作為對番木瓜進(jìn)行性別鑒定的參考。Kim等[43]通過AFLP標(biāo)記揭示了C.papaya的遺傳多樣性，該結(jié)果表明異花授粉的雌雄同體植株具有類似異花授粉雌雄異體植株的變異性；C.papaya與其余6個栽培品種也具有少量的遺傳相似性，其平均值為0.432；而6個栽培品種間的遺傳相似性的平均值則可達(dá)0.729，由此可推測，C.papaya可能是由其余6個品種早期的基因進(jìn)化而來的。
4問題與展望
盡管番木瓜遺傳改良的各方面都取得了一些進(jìn)展，但在實(shí)際生產(chǎn)上仍有許多問題，如抗病、抗寒、優(yōu)質(zhì)及其穩(wěn)定性等未得到根本的解決。因此，利用目前組織培養(yǎng)技術(shù)及分子生物學(xué)等學(xué)科領(lǐng)域的發(fā)展技術(shù)，不僅可以從分子水平上認(rèn)識這些問題，而且還可以通過各種手段來生產(chǎn)經(jīng)遺傳改良的番木瓜品種。如選育能廣泛栽培的抗寒品種，通過可能的育種手段改善果實(shí)風(fēng)味；運(yùn)用基因工程技術(shù)引入外源基因，將可以有目的地提高其抗性以及調(diào)控果實(shí)代謝的相關(guān)過程，解決番木瓜果實(shí)后熟迅速、易損傷腐爛、不耐貯藏的缺陷。也曾有學(xué)者報(bào)道，雌雄異株、株性高度雜合、對病毒敏感是制約番木瓜遺傳改良的三大客觀因素。這些不利因素給番木瓜的大面積種植和雜交育種的后代選擇及性狀穩(wěn)定帶來了困難，因此采用組織培養(yǎng)技術(shù)繁殖具有優(yōu)良性狀及抗病基因型的品種是克服番木瓜實(shí)生苗后代變異、植株感病以及生產(chǎn)大量優(yōu)質(zhì)種苗的好方法。在印度和我國臺灣，這種方法已得到系統(tǒng)研究和生產(chǎn)驗(yàn)證。
目前國內(nèi)外許多育種學(xué)家正努力通過分子標(biāo)記技術(shù)來對番木瓜的基因進(jìn)行探查，對番木瓜的遺傳基礎(chǔ)及遺傳規(guī)律的認(rèn)識正在逐步加深。實(shí)驗(yàn)胚胎學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)、形態(tài)解剖學(xué)及組織培養(yǎng)技術(shù)的不斷發(fā)展，使得遠(yuǎn)緣雜交育種獲得雜種后代，從遠(yuǎn)緣品種中導(dǎo)入抗病基因成為可能；同時，通過人工誘變技術(shù)獲得抗性突變體也是一條較理想的育種途徑。此外，基因工程技術(shù)的應(yīng)用也可以進(jìn)一步導(dǎo)入抗病基因及其他有用的基因。可以預(yù)見，隨著現(xiàn)代生物技術(shù)和信息技術(shù)手段的發(fā)展及廣泛應(yīng)用，番木瓜的遺傳改良將會取得更大的突破，從而對促進(jìn)番木瓜的長足發(fā)展具有重要意義。
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胰腺癌是發(fā)展迅速且預(yù)后不良的惡性腫瘤,手術(shù)切除率較低,術(shù)后復(fù)發(fā)率高,對化療不敏感,目前尚無理想療方法。隨著分子遺傳學(xué)和基因工程技術(shù)的飛速發(fā)展,基因治療逐漸開始應(yīng)用于臨床疾病的研究,近年對自殺基因在腫瘤治療中的作用研究頗多，本文就胰腺癌自殺基因療法研究的新進(jìn)展做一綜述。
一、 自殺基因治療
將自殺基因轉(zhuǎn)導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞,再用相應(yīng)的藥物前體或細(xì)胞毒因子,前者通過自殺基因編碼的特異性酶類將無毒的藥物前體在腫瘤細(xì)胞內(nèi)代謝成毒性產(chǎn)物或細(xì)胞毒因子與其受體結(jié)合,從而達(dá)到殺死腫瘤細(xì)胞的目的,以前又稱為腫瘤的藥物基因治療,也有稱為病毒介導(dǎo)的酶解藥物前體療法(vius directed enzyme prodrug therapy,VDEPT)［1］
二、 自殺基因治療的作用機(jī)制
代謝產(chǎn)物的直接毒性作用 通過分子生物學(xué)技術(shù)將自殺基因轉(zhuǎn)導(dǎo)至腫瘤細(xì)胞中,然后全身或局部注射無毒、低毒的前體化療藥物,由于腫瘤組織中表達(dá)“自殺”基因,編碼酶將前體化療藥物轉(zhuǎn)化為具有殺腫瘤作用的毒性代謝產(chǎn)物,在腫瘤局部形成一個藥物濃聚區(qū),可以增強(qiáng)療效,并減弱化療藥物的全身毒副作用,達(dá)到選擇性殺傷腫瘤的目的。
三、 胰腺癌的自殺基因幾種治療模型
(一) 單純皰疹病毒Ⅰ型胸苷激酶基因及其底物丙氧鳥苷丙氧鳥苷HSV TK基因/GCV HSV
CD基因編碼的胞嘧啶脫氨酶,可將胞嘧啶代謝為尿嘧啶,使5-Fc轉(zhuǎn)化為細(xì)胞毒性代謝產(chǎn)物5-Fu,從而發(fā)揮細(xì)胞毒作用。TK基因治療胰腺癌是通過這種基因編碼的胸苷激酶特異地將核苷類似物藥物前體,如羥甲基無環(huán)鳥苷(Ganciclovir,GCV)磷酸化,進(jìn)而在細(xì)胞進(jìn)一步代謝成三磷酸GCV,后者可抑制細(xì)胞DNA聚合酶的功能或競爭性地滲入細(xì)胞DNA造成DNA合成終止使細(xì)胞死亡。
近年來,HSV TK基因較廣泛地應(yīng)用于胰腺癌治療研究中,Block A等［3］用HSV TK基因/GCV治療胰腺癌肝轉(zhuǎn)移動物模型,結(jié)果體外生長的胰腺癌細(xì)胞高效表達(dá)HSV TK基因,并顯示了“旁觀者效應(yīng)”;荷瘤鼠瘤內(nèi)注射HSV TK,繼之使用GCV 8天,肝轉(zhuǎn)移瘤明顯縮小、壞死。顯示了HSV TK基因殺傷胰腺癌細(xì)胞的作用。。Aoki K［4］在HSV TK基因下游加上一個雜交的強(qiáng)啟動子CAG,結(jié)果14只荷瘤鼠中8只腫塊消失,其余6只鼠瘤塊明顯縮小,而24只對照鼠腫塊無變化,且該研究治療中,未發(fā)現(xiàn)任何毒性反應(yīng)?；蛑委煹陌邢蛐允顷P(guān)系到基因治療的效果問題之一。
（二） EC CD基因/5 FC
EC CD基因可將無毒性的藥物前體5 氟胞嘧啶(5 Fuorocytosine,5-FC)代謝成抗DNA合成的化療藥5-Fu,使腫瘤局部藥物濃度增加,達(dá)到殺死腫瘤細(xì)胞,減輕毒性作用的目的,Autin等最早分離、克隆編碼了EC CD基因,并用逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌細(xì)胞,結(jié)果轉(zhuǎn)導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞被殺傷。Evoy D等，將該方法用于胰腺癌的治療研究,表明了EC CD/5 FC的抗腫瘤作用。同樣也觀察到“旁觀者效應(yīng)”使抗腫瘤作用加強(qiáng)。
四、 聯(lián)合基因治療
（一） 聯(lián)合抑癌基因治療 融合自殺基因治療是利用基因工程技術(shù)將自殺基因和另一種基因連接在一起,以增強(qiáng)自殺基因治療腫瘤的效果。
P 53是一種抑癌基因, Cascallom等發(fā)現(xiàn),野生型P53基因轉(zhuǎn)導(dǎo)能增強(qiáng)吉西他濱和順鉑對胰腺癌細(xì)胞的化療效果,Mercade等以實(shí)驗(yàn)表明P53基因轉(zhuǎn)導(dǎo)對自殺基因治療療效的增強(qiáng)作用,估計(jì)與P53能夠識別破壞的DNA,增強(qiáng)化療對腫瘤的抑制作用有關(guān)。
轉(zhuǎn)染雙自殺基因至SW1990細(xì)胞在體外實(shí)驗(yàn)治療中取得了較好的效果,但在體內(nèi)的應(yīng)用還有很多局限性,而且有資料顯示胰腺癌細(xì)胞對于許多化療藥物存在固有不敏感性.
（二） 聯(lián)合細(xì)胞因子基因治療 轉(zhuǎn)移細(xì)胞因子基因可以誘發(fā)機(jī)體強(qiáng)大的抗腫瘤免疫,其中IL18基因作用較突出。CD基因和IL18基因聯(lián)合轉(zhuǎn)移后,可以協(xié)同發(fā)揮抗腫瘤作用,克服兩者單獨(dú)使用的不足之處,提高機(jī)體對腫瘤的細(xì)胞免疫應(yīng)答,增加機(jī)體的非特異性和特異性抗腫瘤作用。
某些細(xì)胞因子對惡性腫瘤有殺傷作用,目前已有關(guān)于聯(lián)合自殺基因與細(xì)胞因子基因治療的報(bào)道,Judw等在大腸癌細(xì)胞的CD/5 Fc治療模型中,轉(zhuǎn)染淋巴肌動蛋白基因進(jìn)入瘤細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)可以增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤免疫應(yīng)答,增加自殺基因的療效;SakaiY等在肝細(xì)胞癌的HSV tk/GCV治療模型中,輔以單核趨化蛋白 1基因治療,同樣增強(qiáng)了GCV的療效。目前胰腺癌中此項(xiàng)研究尚無報(bào)道。
五、 總結(jié)
綜上所述,自殺基因治療應(yīng)用于胰腺癌等消化道腫瘤的輔助治療已經(jīng)取得了很多成果,但要應(yīng)用于胰腺癌的臨床治療則還有許多問題尚待解決,如基因治療的安全性、轉(zhuǎn)導(dǎo)效率還不夠高,藥物的最佳使用時間以及如何增加療效等。目前研究的重點(diǎn)是:(1)逐步從體外實(shí)驗(yàn)向體內(nèi)實(shí)驗(yàn)過渡,觀察自殺基因治療對大體積腫瘤的療效;(2)解決臨床應(yīng)用的安全性問題,這也是所有基因治療的共同問題。隨著研究的進(jìn)一步深入,自殺基因治療必將會成為一種有效的胰腺癌輔助治療手段。
參考文獻(xiàn)
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［2］ Rosenfeld ME,Vickers SM,Roben D,etal.Pancreatic carcinoma cell killing via adenoviral mediated delivery of the herpes simplex virus thymidine kinase gene.Ann Surg,1997,225(5);609-18.
然而由于種種原因，近年來，作為衡量碩士研究生培養(yǎng)水平重要指標(biāo)的碩士學(xué)位論文的質(zhì)量卻不盡如人意。碩士研究生學(xué)位論文目標(biāo)不明、內(nèi)容空泛、層次不清、推理不嚴(yán)，以及答辯準(zhǔn)備不充分的現(xiàn)象十分普遍。目前，如何提高研究生學(xué)位論文質(zhì)量的問題已引起了各高校學(xué)者與專家們的廣泛關(guān)注。陶勇等[1]對農(nóng)科專業(yè)碩士學(xué)位論文寫作中存在的問題及原因進(jìn)行了全面深入的分析，認(rèn)為從實(shí)驗(yàn)內(nèi)容到具體寫作，都存在或大或小的問題，而研究生與指導(dǎo)教師長期不懈的努力是逐步提高學(xué)位論文水平和研究生素質(zhì)的關(guān)鍵。首都經(jīng)濟(jì)貿(mào)易大學(xué)工商管理學(xué)院院長黃津孚則認(rèn)為[2]要提高碩士論文的質(zhì)量，必須從學(xué)風(fēng)、導(dǎo)師和制度抓起。筆者擬就如何提高農(nóng)業(yè)院校研究生學(xué)位論文質(zhì)量的問題，談幾點(diǎn)認(rèn)識。
堅(jiān)持“化整為零”的原則
堅(jiān)持“化整為零”的原則，即打破畢業(yè)前半年才開始著手撰寫畢業(yè)論文的傳統(tǒng)觀念，在入學(xué)初即告訴學(xué)生碩士學(xué)位論文寫作的一般程序和規(guī)范，幫助學(xué)生合理規(guī)劃三年的學(xué)習(xí)時間，將畢業(yè)論文化整為零的完成。督促學(xué)生從入學(xué)的第一天就要天天、月月、年年想到畢業(yè)論文的撰寫，時時處處為畢業(yè)論文的撰寫做準(zhǔn)備。這樣既可以增加學(xué)生的緊迫感，培養(yǎng)學(xué)生統(tǒng)籌安排的能力，同時也有利于學(xué)生主動將基本理論，基本知識的學(xué)習(xí)與科研實(shí)際相結(jié)合。首先，要求學(xué)生利用課余時間，在前期基礎(chǔ)課學(xué)習(xí)的過程中完成大量文獻(xiàn)的查閱工作，在入學(xué)半年后提交所選研究方向國內(nèi)外研究現(xiàn)狀和實(shí)驗(yàn)方法的綜述，為寫好碩士畢業(yè)論文的前言、材料與方法以及參考文獻(xiàn)部分奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。解決學(xué)生因畢業(yè)論文撰寫時間倉促，導(dǎo)致質(zhì)量偏低的現(xiàn)象。
堅(jiān)持 “三早”的原則
堅(jiān)持貫徹“三早”原則，也就是早選題，早定題，早開題的原則。在學(xué)生入學(xué)初，準(zhǔn)備好一系列與導(dǎo)師研究相關(guān)的題目，比如：大豆油分研究；大豆蛋白質(zhì)品質(zhì)研究；大豆加工適應(yīng)性品質(zhì)研究；大豆種質(zhì)開發(fā)研究；大豆基因組研究等等，供學(xué)生按照自己的愛好選擇課題，激發(fā)學(xué)生的主題意識和主動發(fā)展的愿望。督促學(xué)生盡快選定研究方向，盡早開始文獻(xiàn)查閱。定期給予學(xué)生指導(dǎo)，培養(yǎng)學(xué)生掌握科技文獻(xiàn)檢索、資料查詢與閱讀的方法和能力，同時指導(dǎo)學(xué)生對查閱過的文獻(xiàn)的題目，來源等等按照參考文獻(xiàn)的正規(guī)格式進(jìn)行相應(yīng)的詳細(xì)記錄，以備最后集中撰寫論文時，有的放矢，從而避免學(xué)生隨意堆砌參考文獻(xiàn)，甚至從網(wǎng)上下載，直接粘貼的現(xiàn)象。要求學(xué)生在入學(xué)半年后必須提交合格的開題報(bào)告，徹底改變學(xué)生不讀書，不了解學(xué)科動態(tài)的狀況。
堅(jiān)持“步步為營、不欠賬”的原則
農(nóng)業(yè)生物技術(shù)專業(yè)具有季節(jié)性強(qiáng)，生育周期長的特點(diǎn)，因此，要想保證論文的各個環(huán)節(jié)都有充分的時間得以保質(zhì)保量的完成，在盡早開始進(jìn)入試驗(yàn)狀態(tài)的前提下，還要督促學(xué)生堅(jiān)持做到“步步為營，不欠賬”，也就是要根據(jù)開題報(bào)告中工作進(jìn)度計(jì)劃的安排，認(rèn)真做好每一個階段的工作，比如，播種期做好播種計(jì)劃，適時播種，生育期做好各項(xiàng)生理指標(biāo)的檢測，在秋冬季進(jìn)行分子遺傳學(xué)室內(nèi)分析等，對每一個階段的工作，數(shù)據(jù)要及時進(jìn)行整理，總結(jié)，及時發(fā)現(xiàn)問題，及時解決問題，堅(jiān)決杜絕將所有的原始數(shù)據(jù)堆積到最后分析。防止一旦發(fā)現(xiàn)問題，又沒有可能在短時間內(nèi)補(bǔ)救，只好編造數(shù)據(jù)的現(xiàn)象。保證研究生如期完成學(xué)位論文的撰寫，充分準(zhǔn)備，做好畢業(yè)論文的答辯。
三個“堅(jiān)持”原則的貫徹可以全面提高學(xué)生的綜合能力和素質(zhì)。對于培養(yǎng)富有創(chuàng)新精神和實(shí)踐能力的人才具有重要的意義。首先，通過督促學(xué)生查閱大量的文獻(xiàn)，可以解決學(xué)生不讀書，不了解學(xué)科動態(tài)的問題，同時幫助學(xué)生拓寬相關(guān)知識面；其次，通過對試驗(yàn)設(shè)計(jì)、試驗(yàn)實(shí)施的過程嚴(yán)把質(zhì)量關(guān)，可以培養(yǎng)學(xué)生科學(xué)的態(tài)度及科學(xué)研究的能力，加強(qiáng)對研究生研究方法的教育，提高研究生的學(xué)術(shù)水平。第三，通過把好數(shù)據(jù)分析，論文撰寫及論文答辯的質(zhì)量關(guān)，可以提高學(xué)生的寫作水平，信息處理能力以及語言表達(dá)能力。三個“堅(jiān)持”原則的貫徹使得提高碩士研究生學(xué)位論文質(zhì)量的工作落到實(shí)處，水到渠成的使學(xué)生具備了農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化生產(chǎn)所急需的創(chuàng)造型人才必須具備的各項(xiàng)基本技能。
參考文獻(xiàn)：
關(guān)鍵詞：食管癌 癌基因 抑癌基因
中圖分類號：R34 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1674-098X（2014）10（a）-0020-03
Research on the Changes of Genes in Esophageal cancer
GUAN Xuan WU Jin
（1.School of Basic Medical Sciences， Chengdu Medical College， Sichuan Chengdu ，610500， China；2. Preclinical and Forensic Medicine， Sichuan University， Sichuan Chengdu，610041，China）
Department of Forensic Biology， Sichuan University， Chengdu 610041， China Abstract The onset and development of esophageal cancer is affected by multiple factors. Functional variations of genes may be one of the most important factors. To help the readers understand the importance of oncogenes and cancer suppressor genes in the diagnosis， treatment， prognosis and prevention of esophageal cancer， this review introduces current state of knowledge about the association between genes and esophageal cancer， and the underlying mechanisms.
Key words：esophageal cancer oncogene cancer suppressor gene
食道癌是常見的消化道惡性腫瘤，死亡率居各種癌癥的第6位[1]。主要有鱗癌和腺癌兩種形式。食道癌的發(fā)生發(fā)展是一個涉及多因素、多階段、多基因變異積累及相互作用的過程[2，3]。目前研究認(rèn)為，在細(xì)胞癌變過程中，癌基因的激活和抑癌基因的失活可能是細(xì)胞癌變的分子基礎(chǔ)，細(xì)胞凋亡相關(guān)基因和腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因異常等也與之有關(guān)[4]。因此，加強(qiáng)對食道癌特異的分子遺傳學(xué)學(xué)變化的研究，不僅有助于闡明其發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制，而且對臨床治療也有一定的指導(dǎo)作用。
癌基因（oncogene）是人類或其他動物細(xì)胞（以及致癌病毒）固有的一類基因，又稱轉(zhuǎn)化基因，它們一旦活化便能促使人或動物的正常細(xì)胞發(fā)生癌變。抑癌基因（cancer suppressor genes）是指產(chǎn)生直接或間接抑制細(xì)胞增殖、癌變的腫瘤抑制基因，其在腫瘤的發(fā)生、治療與預(yù)后中發(fā)揮著重要作用。
癌基因和抑癌基因的研究對于食道癌的早期診斷、判斷預(yù)后、治療及預(yù)防等方面都有重要的意義，將會為食道癌的診斷與治療提供科學(xué)的分子基礎(chǔ)和理論依據(jù)。
1 癌基因
1.1 myc基因
myc族基因是白基因家族，為細(xì)胞內(nèi)的原癌基因，基因定位于8q23，主要包括C-myc，L-myc，N-myc。較多的研究證實(shí)其表達(dá)與細(xì)胞增生、腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。Sarbia等[5]通過對食道癌發(fā)生不同階段的C-myc表達(dá)情況進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)在重度不典型增生上皮和腺癌標(biāo)本才有C-myc基因擴(kuò)增現(xiàn)象，從而認(rèn)為C-myc基因擴(kuò)增在食管腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程中是一個晚期事件。國內(nèi)楊立峰[6]等研究發(fā)現(xiàn)，myc基因擴(kuò)增率高的食道癌患者其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率及外侵性顯著高于對照組，以此可以推測，myc基因過度表達(dá)的食道癌細(xì)胞預(yù)示高度惡性、侵襲、轉(zhuǎn)移率高，治療預(yù)后差。
1.2 C-erbB-2基因
C-erbB-2基因定位于17q21，最早在乙基亞硝基脲引起的大鼠神經(jīng)母細(xì)胞癌株中發(fā)現(xiàn)，可以編碼184kU的具有酪氨酸酶活性的跨膜糖蛋白，后續(xù)研究認(rèn)為其在細(xì)胞增殖和分化調(diào)控中起重要作用。Lam等[7]研究癌旁不典型增生組織及Barrett粘膜中發(fā)現(xiàn)C-erbB-2的基因擴(kuò)增和過表達(dá)，認(rèn)為這一現(xiàn)象可能是部分食道癌發(fā)生中的早期事件，也有研究表明其在食道癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮作用，提示C-erbB-2蛋白表達(dá)陽性者較陰性者更容易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[8]，導(dǎo)致預(yù)后不佳。
1.3 CyclinD基因
CyclinD基因，又稱為prad1基因，位于11q13號染色體上，目前研究認(rèn)為其是一種細(xì)胞周期相關(guān)癌基因。CyclinD基因可編碼CyclinD1蛋白，后者是細(xì)胞周期結(jié)構(gòu)成分，G1～S轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵周期蛋白。在食管鱗癌中常發(fā)現(xiàn)CyclinD1基因擴(kuò)增或過表達(dá)，并與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分期和生存率下降等相關(guān)。Roncalli[9]等研究發(fā)現(xiàn)，食道癌組織中存在CyclinD基因的擴(kuò)增和過度表達(dá)，正常食管上皮和胃粘膜組織則無基因擴(kuò)增和過度表達(dá)現(xiàn)象。CyclinD基因與抑癌基因Rb及p16關(guān)系密切，有研究認(rèn)為cyclinD和p16在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期活動中構(gòu)成反饋調(diào)節(jié)通路[10]，并產(chǎn)生相互拮抗作用，兩者任一發(fā)生突變或過表達(dá)等異常均可引起調(diào)節(jié)通路障礙而表現(xiàn)為細(xì)胞增殖失控，細(xì)胞過度增殖并導(dǎo)致癌癥的發(fā)生。
1.4 MTA1基因
MTA1是新近發(fā)現(xiàn)的一個腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移侯選基因，位于人染色體14q32.3，基因全長為2.2kb，編碼一個含703個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)mtal，分子量為79.4 kD，屬于核小體重構(gòu)和脫乙?；鶑?fù)合物（NuRD）的組成成員之一，它通過促進(jìn)組蛋白脫乙?；绊懟虻霓D(zhuǎn)錄和復(fù)制，參與信號傳導(dǎo)和基因表達(dá)調(diào)節(jié)，與多種腫瘤組織，尤其是上皮源性惡性腫瘤組織的侵襲轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)[11]。Toh等[12]對47例食管鱗癌標(biāo)本進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，47例樣本中有16例發(fā)生MTA1基因高表達(dá)，且與食道癌發(fā)生血管浸潤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。王俊平等[13]研究亦發(fā)現(xiàn)人食管鱗癌組織MTA1蛋白表達(dá)明顯升高，MTA1與食道癌的發(fā)生發(fā)展及浸潤轉(zhuǎn)移有關(guān)。
1.5 MET基因
MET基因定位于7q31區(qū)，其編碼產(chǎn)物為一種190 000的酪氨酸激酶受體，是一種腫瘤轉(zhuǎn)化基因。作用機(jī)制可能為其編碼受體通過與肝細(xì)胞因子相結(jié)合，進(jìn)而使酪氨酸激酶磷酸化，啟動細(xì)胞的有絲分裂，并促進(jìn)細(xì)胞變形和向腺上皮的形態(tài)分化。Hu等通過對61例食管鱗狀細(xì)胞癌樣本的研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)MET的表達(dá)率高達(dá)91.8%，且與食管鱗癌的分化程度明顯相關(guān)。秦艷茹等[14]研究發(fā)現(xiàn)，MET在食道癌組織中的陽性率高于癌旁正常組織，食道癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織中MET的陽性率高于癌組織，提示MET可能與食道癌不良預(yù)后和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。
2 抑癌基因
2.1 DPC4
DPC4基因是重要的抑癌基因，定位于染色體18q21.1。其編碼蛋白Smad 4是轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor，TGF）超家族受體的直接底物。在TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，DPC4與不同的Smad蛋白相互作用是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的中心環(huán)節(jié)。腫瘤DPC4基因失活，會導(dǎo)致Smad-TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的破壞，從而失去對腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用[15]，因此DPC4也可被認(rèn)為是一種腫瘤抑制劑[16]。
有研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)SP法檢測了174例食道癌組織和30例癌旁正常食管黏膜的DPC4基因的蛋白表達(dá)，研究顯示DPC4在癌旁正常食管黏膜和食道癌中的陽性表達(dá)率分別為80%、40.8%，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明DPC4的低表達(dá)與食道癌的發(fā)生有一定的關(guān)系。研究表明，DPC4的表達(dá)缺失與組織分化有關(guān)，分化越差的惡性腫瘤，DPC4的缺失率越高[17]。
2.2 PTEN
PTEN又稱MMAC1或TEP1，是Li等[18]從原發(fā)性乳腺癌、前列腺癌以及膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株克隆得到的，定位于人染色體10q23.3，是一種具有雙特異性磷酸酶活性的新型抑癌基因，也是目前惟一具有磷酸酶活性的抑癌基因，該基因可通過對PIP3脫磷酸，抑制PIP3/PKB生存信號在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，誘導(dǎo)細(xì)胞停滯在G1期或促使細(xì)胞凋亡[19]，在腫瘤細(xì)胞浸潤、腫瘤轉(zhuǎn)移中起到一定作用[20]。而至今在食道癌研究表明，PTEN基因突變在食道癌組織中的發(fā)生頻率較低，而僅表現(xiàn)為蛋白表達(dá)普遍下降[21]。PTEN蛋白在正常食管鱗狀上皮和癌組織都主要表達(dá)于細(xì)胞漿內(nèi)，胞核內(nèi)也可見，呈棕黃色顆粒[20]。李勁松等研究顯示[22]， PTEN在食管鱗癌中的表達(dá)率明顯低于癌旁正常食管黏膜組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Tachibana等[23] 研究發(fā)現(xiàn)PTEN的表達(dá)隨著腫瘤的惡性程度升高有下調(diào)的趨勢。蔣虹等[24]研究發(fā)現(xiàn)，食道癌組織中PTEN表達(dá)水平明顯低于癌旁組織，呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，且隨著食道癌的進(jìn)展，其表達(dá)呈逐漸下降趨勢[25]。
2.3 DMBT1
DMBT1基因位于人類染色體10q26.13，因在髓母細(xì)胞瘤和膠質(zhì)細(xì)胞瘤中廣泛缺失而得名，該基因表達(dá)產(chǎn)物可促進(jìn)細(xì)胞的分化，發(fā)揮其抑制腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移的作用。研究表明，該基因表達(dá)下調(diào)、缺失、突變失活與多種腫瘤，特別是與上皮細(xì)胞腫瘤的發(fā)生發(fā)展、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤浸潤深度存在一定相關(guān)性。張光斌[26]等研究發(fā)現(xiàn)DMBT1在體外的過表達(dá)會抑制食道癌細(xì)胞的侵襲，但具體機(jī)制目前還不能闡述清楚。王越英等[27]研究報(bào)道，在食道癌組織中，DMBT1mRNA陽性表達(dá)缺失率存在明顯增高，且其缺失率于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤外侵嚴(yán)重程度明顯相關(guān)。
2.4 nm23
nm23由Steeg等在1988年從K-1753鼠黑色素瘤細(xì)胞株分離出來，是腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因。該基因在人類定位于染色體17q21-22，全長8.5 kb。陳艷[28]等對哈薩克族食道癌樣本的研究中發(fā)現(xiàn)，nm23-H1低表達(dá)與腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移高度相關(guān)，其可能機(jī)制為nm23-H1低表達(dá)導(dǎo)致食道癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移表型，并改變了其生物學(xué)行為，進(jìn)而與腫瘤的浸潤及淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)。
3 結(jié)語
總之，食道癌變是一個多階段進(jìn)行性演變過程，其病因?qū)W研究涉及遺傳和環(huán)境多個方面。在其遺傳病因?qū)W研究方面，眾多的研究涉及到多種相關(guān)或獨(dú)立的基因或分子改變，并認(rèn)為食道癌變是多種基因變化綜合作用的結(jié)果。但各種分子事件在食道癌腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的作用比重及機(jī)制，目前尚缺乏權(quán)威數(shù)據(jù)，需要進(jìn)一步研究。近年來，食道癌的遺傳學(xué)研究主要集中于尋找并研究癌變早期基因，并進(jìn)一步深入探討其致癌機(jī)制，以實(shí)現(xiàn)食道癌的早期診斷、治療、高危人群早期檢測及生物防治，為降低食道癌的發(fā)病率和病死率提供參考或依據(jù)。食道癌基因治療的研究也形成一定的規(guī)模，有望在不久的將來實(shí)現(xiàn)突破。
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關(guān)鍵詞：原子力 顯微鏡 生物醫(yī)學(xué) 應(yīng)用
1 原子力顯微鏡工作原理
原子力顯微鏡（Atomic force microscopy，AFM）是一種以物理學(xué)原理為基礎(chǔ)，通過掃描探針與樣品表面原子相互作用而成像的新型表面分析儀器。它屬于繼光學(xué)顯微鏡、電子顯微鏡之后的第三代顯微鏡。AFM通常利用一個很尖的探針對樣品掃描，探針固定在對探針與樣品表面作用力極敏感的微懸臂上。懸臂受力偏折會引起由激光源發(fā)出的激光束經(jīng)懸臂反射后發(fā)生位移。檢測器接受反射光，最后接受信號經(jīng)過計(jì)算機(jī)系統(tǒng)采集、處理、形成樣品表面形貌圖像。早期研制的為接觸式原子力顯微鏡，它包括恒力模式和恒高模式。前者利用反射光位移引起的光電二極管輸出電壓的變化構(gòu)成反饋回路控制壓電陶瓷管伸縮，從而調(diào)節(jié)固定于掃描器上樣品的位置，保持樣品和探針間作用力（懸臂彎曲度）不變，測量每一點(diǎn)高度的變化。后者保持樣品和探針間的距離不變，測量每一點(diǎn)作用力的大小。這種模式在調(diào)節(jié)探針與樣品距離前即可直接觀測懸臂彎曲度的改變。除傳統(tǒng)的接觸式之外，1993年又研制出輕敲式原子力顯微鏡。該顯微鏡在掃描過程中探針與樣品表面輕輕接觸，懸臂受存在于兩者間的排斥力作用隨樣品表面起伏發(fā)生高頻振顫。由于探針與樣品的接觸短暫，因此它更適用于質(zhì)地脆或固定不牢的樣品 ［1］ 。
2 原子力顯微鏡的應(yīng)用
在AFM誕生最初的一段時間主要應(yīng)用于電化學(xué)、材料科學(xué)等領(lǐng)域。近些年，人們逐漸探索著運(yùn)用AFM對生物樣品進(jìn)行納米水平的觀測及顯微操作等。與其它顯微鏡相比，AFM的納米量級的高空間分辨率尤為突出，橫向分辨率可達(dá)0.1～0.2nm，縱向分辨率高達(dá)0.01nm。此外，它不但能夠?qū)ι頎顟B(tài)下的樣品成像，而且可以實(shí)時動態(tài)地研究樣品結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系。故而，AFM成為納米尺度上研究物質(zhì)結(jié)構(gòu)、特性和相互作用的有力手段。以下主要對這項(xiàng)納米技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域中取得了顯著的成績作一綜述。
2.1 形態(tài)結(jié)構(gòu) 作為新興的形態(tài)結(jié)構(gòu)成像技術(shù)，AFM實(shí)現(xiàn)了對接近自然生理?xiàng)l件下生物樣品的觀察。這主要由于它具備以下幾個特點(diǎn):（1）與掃描電鏡和透射電鏡這些高分辨的觀測技術(shù)相比，樣品制備過程簡便，可以不需染色、包埋、電鍍、電子束的照射等處理過程;（2）除對大氣中干燥固定后樣品的觀察外，還能對液體中樣品成像;（3）可以根據(jù)觀察者的要求，調(diào)節(jié)樣品所處的溫度、濕度、大氣、真空等觀察條件。目前，AFM已廣泛地應(yīng)用于細(xì)胞及蛋白、多糖、核酸等生物大分子結(jié)構(gòu)的研究中。對一個細(xì)胞而言，AFM不但能夠提供長度、寬度、高度等形態(tài)方面的信息，還可以滿足人們對膜上的離子通道、絲狀偽足、細(xì)胞間連接等細(xì)微結(jié)構(gòu)的研究 ［2，3］ ，甚至還可清楚地觀察到膜身的骨架結(jié)構(gòu) ［4］ 。后者對細(xì)胞表面與表面下結(jié)構(gòu)相互作用的進(jìn)一步研究非常有利。Qian ［5］ 等利用AFM對酵母的熱休克蛋白Sis1與Ssa1進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)只有Ssa1的lid區(qū)一端與Sis1縮氨酸結(jié)合區(qū)作用，并且Sis1二聚體的縮氨酸結(jié)合區(qū)呈現(xiàn)較高水平的凹槽結(jié)構(gòu)，這有助于闡明蛋白相互作用機(jī)制及其在蛋白折疊、組裝、降解、轉(zhuǎn)移中的重要作用。定的生理生化反應(yīng)會引起生物樣品空間結(jié)構(gòu)的變化。利用AFM對這些變化的觀察，為細(xì)胞結(jié)構(gòu)及結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)的生理意義等研究提供更多有價值的信息。例如Liu ［6］ 等將大麥的中期染色體經(jīng)嚴(yán)格點(diǎn)干燥、2M NaCl處理后提取出2種非組蛋白。通過AFM在納米水平顯示提取蛋白后染色體的三維結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)處理后的染色體發(fā)生下列變化:高度降低同時表面較前粗糙。又如:Sit ［7］ 將纖維蛋白原固定在3種不同基底表面，研究樣品發(fā)生的結(jié)構(gòu)變化。由AFM的三維定量分析顯示纖維蛋白原按照mica
2.2 力學(xué)特性 由于利用AFM可對掃描各點(diǎn)高度及作用力的測量，這就意味著我們不僅可以獲取生物樣品的表面形態(tài)和三維結(jié)構(gòu)，還可以得到其表面硬度、粘彈性、摩擦力等力學(xué)特性的表面圖譜 ［10］ 。例如AFM在掃描樣品時，探針尖端作用樣品可使樣品產(chǎn)生可測量的凹陷。當(dāng)應(yīng)力與應(yīng)變力成線性關(guān)系時，樣品發(fā)生的變形屬彈性變化，即撤銷力時樣品可恢復(fù)原有形態(tài)。我們利用凹陷的深度數(shù)據(jù)就能夠獲取有關(guān)樣品局部的彈性信息。Alcaraz ［11］ 等利用AFM測量支氣管上皮和肺泡上皮細(xì)胞在不同負(fù)荷力和作用頻率下的復(fù)剪切彈性系數(shù)，觀察其變化規(guī)律。在樣品表面性能測量中，應(yīng)該考慮到探針可能同時會受到其他作用而影響實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。在該實(shí)驗(yàn)中作者就針對溶液粘性牽拉力及與樣品接觸的探針幾何形狀引起的偏差予以校正，使測量結(jié)果更準(zhǔn)確。
2.3 分子間力 將很高的空間分辨率與敏感且準(zhǔn)確的力學(xué)感應(yīng)性相結(jié)合，是AFM的一個極為顯著的特點(diǎn)。通過將探針連接在彈性系數(shù)很小的懸臂上，AFM對力的測量敏感性可達(dá)到pn水平。到目前為止，AFM已經(jīng)廣泛地運(yùn)用于測量溶液中生物分子間相互作用如與生物反應(yīng)有關(guān)的水合力的研究 ［12］ 。利用這些研究結(jié)果還有助于對生物分子結(jié)構(gòu)和機(jī)械性能進(jìn)行分析。例如，蛋白質(zhì)依靠多種非共價作用而保持其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，通過機(jī)械或化學(xué)的方法將蛋白伸展后，可以利用AFM直接測量穩(wěn)定蛋白結(jié)構(gòu)的作用力，并進(jìn)一步探究這些力對蛋白結(jié)構(gòu)的影響。近幾年AFM對肌蛋白titin的去折疊研究取得的顯著成果即有力地說明了這一點(diǎn) ［13］另外，AFM還能夠測量單個分子間微弱的非共價力。例如測量受體-配體的去結(jié)合力，若受體固定在基底表面的話，則將與之對應(yīng)的配體固定于探針表面，使探針功能化。隨探針-樣品的距離逐漸縮小，懸臂受探體-樣品間吸引或排斥力的作用向接近或遠(yuǎn)離樣品的方向偏折，懸臂偏折的最大幅度反映分離緊密結(jié)合兩分子所需的力。在測量中，有可能會受到探針與表面的非特異性相互作用的干擾 ［14］ 。因此，有必要認(rèn)真地選擇對照實(shí)驗(yàn)包括使用未功能化探針;或基底所處的溶液中利用游離的配體封閉受體;調(diào)節(jié)溶液的離子強(qiáng)度或pH，降低靜電力的干預(yù) ［15］ 。除此之外，探針還有可能受溶液粘性牽拉力作用，使撤離速率減慢至記錄數(shù)據(jù)低于實(shí)際的作用力。
2.4 顯微操作 通過在納米級水平調(diào)控探針的位置和施加力，AFM可以實(shí)現(xiàn)對生物分子進(jìn)行物理操作如切割生物結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)移分子至特定位置。在一定的范圍調(diào)整施加力，AFM在成像的同時即可對樣品進(jìn)行操作。施加力的范圍主要由懸臂的力學(xué)常數(shù)和探針粗細(xì)決定。與標(biāo)準(zhǔn)顯維切割技術(shù)相比，AFM對目標(biāo)區(qū)域切割、提取等操作具有更準(zhǔn)確的特點(diǎn)。1992年Hansma ［16］ 利用AFM切割遺傳物質(zhì)DNA分子的特定位置，這是人們首次使用AFM對生物分子進(jìn)行的可控性納米操縱。隨后它在生物膜的切割 ［17］ 、待研究分子的分離 ［18］ 等方面也得到廣泛的應(yīng)用。
3 AFM在染色體研究方面的進(jìn)展
AFM的高分辨成像和簡便的樣品制備過程吸引了眾 多學(xué)者利用它對染色體結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究。但早期由于鑲嵌于30nm蛋白質(zhì)層的RNA吸附在染色體的表面 ［19］ ，同時鹽、細(xì)胞殘?jiān)入S同染色體滴片時吸附于玻片上 ［20］ ，妨礙染色體表面更細(xì)微的結(jié)構(gòu)成像。近來隨著染色體制備方法的改善和AFM成像技術(shù)的提高，該方面的研究得到進(jìn)一步的發(fā)展。染色體經(jīng)胃蛋白酶、RNA酶依次作用后，置于溶液中觀察，不僅去除了表面的蛋白質(zhì)層，而且再次水化后染色體體積增大5～7倍，能夠分辨出樣品表面的染色質(zhì)纖維所形成的環(huán)狀結(jié)構(gòu) ［19］ 。最近利用該方法使染色體成像橫向和縱向分辨率分別可達(dá)到1nm、0.1nm，并且發(fā)現(xiàn)染色質(zhì)纖維是由放射狀排列染色質(zhì)環(huán)與盤繞的螺旋管狀結(jié)構(gòu)共同組成 ［21］ 。在G、C分帶中期染色體的三維結(jié)構(gòu)觀察 ［7］ ，染色單體型畸變識別 ［8］ ，核型分析等方面研究的應(yīng)用證實(shí)了與光學(xué)顯微鏡、掃描及透射電鏡等成像工具相比AFM具備獨(dú)特的優(yōu)勢:它不僅能夠識別染色體畸變，同時可以對結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行細(xì)微的觀察。除正常染色體的結(jié)構(gòu)及表面性質(zhì)的研究，AFM還對G分帶染色體形態(tài)發(fā)生的一系列變化進(jìn)行觀察。研究發(fā)現(xiàn)隨胰蛋白酶作用時間的延長，染色體除周邊之外的其余結(jié)構(gòu)將逐漸發(fā)生崩解 ［22］ 。中期染色體經(jīng)G、C分帶會出現(xiàn)縱向高度的差異 ［23，24］ ，各條帶中染色質(zhì)纖維排列的松緊度也有所不同 ［25］ 。這些都有助于染色體分帶機(jī)制的闡明。對重離子射線誘發(fā)染色體畸變分析發(fā)現(xiàn)AFM不但識別出染色單體裂隙和單體斷裂，還清楚觀察到單體型畸變的斷裂點(diǎn)纖維狀結(jié)構(gòu) ［26］ 。這證實(shí)了AFM是輻射誘發(fā)染色體畸變的結(jié)構(gòu)研究中十分有用的工具?？梢?，AFM已在染色體結(jié)構(gòu)、物理性質(zhì)等方面研究獲得很大的進(jìn)展。另外，作為一種納米操縱工具，AFM還被用于納米切割染色體，提取DNA制作FISH實(shí)驗(yàn)的探針等 ［27］ 。
在亞細(xì)胞水平結(jié)構(gòu)研究的基礎(chǔ)上，發(fā)揮AFM連接亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)、分子水平研究的橋梁作用，它有可能在基因定位和功能研究等方面得到進(jìn)一步的應(yīng)用與發(fā)展。綜上，憑借它對染色體納米量極的成像和顯微操縱，AFM有希望成為結(jié)合細(xì)胞遺傳學(xué)和分子遺傳學(xué)的有力工具。
4 展望
1986年，AFM作為一種新的成像技術(shù)被研制成功。在之后短短的十余年里它由原有的納米水平單分子成像，逐漸擴(kuò)展到表面功能的研究，分子間力的測量，可控性分子操作等多個領(lǐng)域。當(dāng)然，不容忽視，在上述的AFM多種應(yīng)用中仍存在一些有待進(jìn)一步完善、解決的問題，也就是說，作為一個新興的研究工具，它同樣也存在著自身的不足。除了在實(shí)驗(yàn)中不斷地分析、探求更好的解決方法之外，我們更應(yīng)該將AFM與其他成像工具相結(jié)合，取長補(bǔ)短，以便能夠更大程度地挖掘其內(nèi)在潛力，使AFM在生物醫(yī)學(xué)研究中做出更大的貢獻(xiàn)。相信隨著這項(xiàng)多功能技術(shù)的相關(guān)工作的不斷發(fā)展，它會為形態(tài)結(jié)構(gòu)、表面功能、相互作用力等方面研究提供更多、更重要的新發(fā)現(xiàn)。 參考文獻(xiàn)
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